马超 金焰 段希斌 曹巍 邢国臣 易善永 李学民 王晓飞

结直肠癌是一种严重威胁人类生命健康的消化道恶性肿瘤，发病率和致死率均较高［1-2］。目前，外科手术是治疗结直肠癌有效的手段之一，但多数患者就诊时己是中晚期，失去手术治疗时机，一般选择化疗。伊立替康联合氟尿嘧啶是临床上治疗晚期结直肠癌的一线化疗方案，其有效率较高，但同时不良反应也较高，这限制了其在临床上的广泛应用，因此，探讨伊立替康毒性及疗效的预测因素对提高伊立替康的安全性和有效性具有重要意义［3］。

伊立替康是一种前体药物，在肝脏内经羧酸酯酶转化为活性代谢产物SN-38，继而发挥抗肿瘤活性。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡醛酰转移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase，UGT）灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38 （SN-38G）［4］，从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。一少部分SN-38G、伊立替康及其代谢物随尿液排出体外，但大部分SN-38G经胆汁分泌进入肠道，并在肠道β-葡萄糖醛酸酶的作用下重新转换为SN-38，从而引起肠道黏膜损害，导致迟发性腹泻的发生［5］。UGT1A1影响伊立替康活性产物SN-38与灭活产物SN-38G的相互转化，从而导致毒性的个体差异，这一方面已有大量文献进行研究。而ABC（ATP-bindingcassette transporter，ABC）转运蛋白超家族主要负责将细胞内的伊立替康、SN-38 及代谢物转至胞外，因此推测，其遗传多态性也是造成伊立替康毒性个体差异的原因之一。但有关药物转运体遗传多态性对伊立替康毒性的影响研究相对较少。本研究主要选用治疗方案包含伊立替康的结直肠癌患者，分析ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因多态性与3级以上迟发性腹泻和中性粒细胞减少发生率之间的关系，探讨伊立替康严重毒性反应的遗传因素，为结直肠癌患者使用伊立替康进行个体化治疗提供依据。

资料与方法

一、一般资料

选取2014年1月至2016年12月郑州大学附属郑州中心医院肿瘤科及胃肠外科收治的晚期结直肠癌患者91例，全部接受伊立替康治疗，且在实验前签署知情同意书。受试者在化疗前进行如下检查：骨髓造血功能，肝、肾功能和Karnofsky评分。化疗前，抽取患者外周静脉血2～3 ml，用EDTA抗凝。该研究方案获得郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会批准。

入选标准：①不可切除或复发转移的结直肠癌患者；②年龄范围：20～80岁；③入组前四周内未经历外科手术、化疗和放疗；④预计生存期＞3个月；⑤脏器功能达到基线水平，即白细胞计数＞4×109/L，血小板计数＞1×1011/L，血红蛋白＞9×103g/L，中性粒细胞数＞2×109/L，丙氨酸氨基转移酶（ALT）＜35 U/L，天冬氨酸氨基转移酶（AST）＜40 U/L，血清肌酸酐＜1.5 g/L，总胆红素＜1.5 g/L。

排除标准：①严重的传染病或并发症（如肺纤维化或间质性肺炎，不可控制的糖尿病）；②严重的胸腔积液或腹腔积液；③慢性腹泻、麻痹性肠梗阻或肠梗阻；④有药物过敏史。

二、研究方法

（一）外周血基因组DNA提取

参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书，采用柱提取法提取患者外周血基因组DNA，于-80 ℃保存备用。

（二）基因分型采用PCR扩增目的片段，产物直接测序分析

1. ABCB1-3435C＞T基因分型

PCR扩增引物序列为：正向引物序列5′-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3′，反向引物序列 5′-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3′，25 μl PCR反应体系包括：8.5 μl灭菌超纯水，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，1 μl上游引物（10 μM），1 μl下游引物（10 μM），2 μl DNA模板。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；最后72 ℃ 5 min。

2. ABCC2-24C＞T基因分型

PCR扩增引物序列为：正向引物序列5′-CTGTTCCACTTTCTTTGATGA-3′，反向引物序列5′-TCTTGTTGGTGACCACCCTAA-3′，25 μl PCR 反应体系包括：8.5 μl灭菌超纯水，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix，1 μl上游引物（10 μM），1 μl下游引物（10 μM），2 μl DNA模板。PCR扩增条件：95 ℃12 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；最后72 ℃ 5 min。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，依据PCR产物片段大小，初步检测PCR的特异性，符合标准后，直接测序，分析ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T 基因型。

三、病例资料收集

观察并记录患者发生迟发性腹泻、中性粒细胞减少等不良反应的发生情况，根据美国国立癌症研究院（National Cancer Institute，NCI）提出的肿瘤药物不良反应分级标准NCI-CTC（4.0）对药物毒性进行评价。

四、统计学分析

应用SPSS17. 0 软件分析数据，采用χ2检验或Fisher′s精确概率法比较各基因型之间的不良反应，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因分型结果

本研究共包括结直肠癌患者91例，其中男性59例，女性32例，年龄范围36～77岁，平均年龄62.4岁；体重范围46～80 Kg，平均体重59.1 Kg。ABCB1-3435C＞T基因分型结果为：CC型44例、CT型34例和TT型13例；ABCC2-24C＞T基因分型结果为：CC型65例、CT型23例和TT型3例。91例受试者，有50例为首次使用包含伊立替康的治疗方案，41例为非首次使用包含伊立替康的治疗方案。ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因型和等位基因分布频率见表1，所有单核苷酸多态性（SNPs）分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

二、ABCB1-3435C＞T和ABCC2-24C＞T基因多态性与伊立替康所致严重不良反应的关系

本研究选取91例使用伊立替康治疗的结直肠癌患者，其中14例发生3～4级迟发性腹泻，36例发生3～4级中性粒细胞减少。在使用伊立替康的患者中，有50例患者为首次使用该药，41例患者为非首次使用该药，两者之间严重不良反应的发生情况差异无统计学意义（χ2=0.583，P=0.445；χ2=0.276，P=0.599）。

表1 受试者ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因型及等位基因分布频率

ABCB1-3435C＞T 三个基因型CC、CT和TT，3～4级迟发性腹泻和中性粒细胞减少的发生情况差异均无统计学意义（χ2=0.237，P=0.888；χ2=2.139，P=0.343）。

ABCC2-24C＞T 三个基因型CC、CT和TT，3～4级迟发性腹泻的发生频数分别为6、7和1；3～4级中性粒细胞减少的发生频数分别为22、12和2。在比较严重化疗毒性的发生差异时，由于TT型例数较少，仅有3例，我们将突变纯合子TT型和突变杂合子CT型合并后，与野生纯合子CC型比较，结果显示迟发性腹泻的发生情况在两者之间差异有统计学意义（χ2=5.067，P=0.024），而中性粒细胞减少的发生情况在两者之间差异无统计学意义（χ2=3.107，P=0.078），见表2。

讨 论

在我国，随着人们饮食习惯、生活习性及居住环境的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势［6］。结直肠癌具有早期症状隐匿、临床表现缺乏特异性及易发生肝转移等特征，这造成了15～25%的患者在初次就诊时就已经属于晚期且合并肝转移［7］，错过了根治性手术治疗的最佳时期。目前，伊立替康联合氟尿嘧啶是临床上治疗晚期结直肠癌标准的一线化疗方案，有效率在40%以上，可显著延长患者的生存期。但该方案的应用受到严重不良反应的限制，且个体间差异较大［8］，这种毒副作用通常被认为与遗传因素有关。近些年研究的焦点集中在伊立替康活性代谢产物的主要代谢酶UGT1A1，其基因多态性可使酶的活性存在差异，前期我们也做了这方面的相关研究。此外，由于ABC转运蛋白超家族负责将细胞内的伊立替康、SN-38 及其它代谢物转运至胞外，我们推测ABC转运蛋白基因多态性可能也会影响伊立替康转运出细胞的能力，从而影响药物毒性。

表2 ABCB1-3435C＞T和ABCC2 -24C＞T基因多态性与伊立替康所致严重不良反应的关系

P-糖蛋白是人体内重要的转运蛋白，具有较广泛的作用底物，在药物代谢过程中起重要作用。当其编码基因ABCB1发生变异时，则引起P-糖蛋白表达与活性的改变［9-10］。ABCB1-3435C＞T基因多态性在中国人群中具有较高的突变频率。曾有研究报道，野生纯合子CC型P-糖蛋白的表达量较突变纯合子TT型高出2倍［11-12］；还有研究结果显示，CC型个体在接受化疗后具有更好的临床疗效，ABCB1基因多态性通常被认为与伊立替康的药效学和药动学有关［13-15］。Lin等［16］研究表明，ABCB1-3435C＞T突变纯合子TT型能够显著降低ABCB1蛋白的表达，具有TT基因型的患者药物转出细胞的能力较弱，从而导致伊立替康毒性反应的风险降低。还有一项关于伊立替康毒性的研究结果与上述观点一致［17］，研究者认为，携带ABCB1-3435C＞T多态性T等位基因的患者，发生严重腹泻的风险低于C等位基因。但Glimelius等的研究与之相反，他们的研究结果显示，ABCB1-3435C＞T TT型能够显著增加伊立替康早期毒性的风险［18］。在本研究中，我们对91例治疗方案包含伊立替康的结直肠癌患者进行研究，比较ABCB1-3435C＞T不同基因型之间严重化疗毒性的发生情况，结果显示，三个基因型之间3级以上迟发性腹泻和中性粒细胞减少的发生情况均无显著性差异，这可能是由于临床上为了避免伊立替康引起严重的毒性反应，有意降低伊立替康剂量，从而造成ABCB1-3435C＞T突变对其伊立替康毒性的影响结果不一致。Ⅱ期临床研究显示，大约40%的患者可能够耐受更高的伊立替康剂量达500～700 mg/m2［19］，这就迫切需要找到能够精准预测伊立替康严重毒性反应的标志物，筛选出少数仅能使用较低剂量的人群和多数可使用较高剂量的人群，从而提高临床疗效，降低毒性。

多药耐药相关蛋白 2（MRP2），也叫ABCC2转运蛋白，由ABCC2基因编码。这是一种ATP 结合盒外排性转运蛋白，对底物化合物的跨膜转运起重要作用。因此，ABCC2 基因单核苷酸多态性可能是引起许多临床药物反应个体差异的重要因素。Innocenti等［20］对85个使用伊立替康治疗的癌症患者进行研究，结果发现，ABCC2-24C＞T多态性T等位基因对伊立替康药动学与药效学均有显著影响。本研究结果显示，ABCC2-24C＞T基因多态性与结直肠癌患者伊立替康所致严重腹泻有关，这可能是由于ABCC2-24C＞T突变造成ABCC2 转运蛋白转运能力减弱，伊立替康及代谢物在细胞内大量聚集，导致毒性增强所致。此外，ABCC2-24C＞T三个基因型CC、CT和TT之间中性粒细胞减少的发生频率也有差异，但没有达到统计学意义（P=0.078），这可能与样本例数较少有关。在今后的研究中，如果能加大样本量，可以更好的确定ABCC2-24C＞T基因多态性对伊立替康所致中性粒细胞减少的影响。

由于伊立替康在临床上的普遍应用，其毒性一直受到广泛关注。近年来大家聚焦的中心在于其主要代谢酶UGT1A1基因多态性对其毒性的影响，也普遍认为UGT1A1*28和*6对结直肠癌患者伊立替康毒性反应影响较大，我们前期的研究也能够证明此观点［21］。此外，参与伊立替康处置过程的药物转运体ABCB1和ABCC2的影响仍不可忽视。本研究结果显示，ABCC2-24C＞T基因多态性与结直肠癌患者伊立替康所致迟发性腹泻有关，但由于目前该方面相关文献较少，我们仍需进行大样本量多中心的验证。

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