王英舟 刘梅芳 谢东锋 张春燕

(济宁医学院药学院，日照 276826)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病， 其临床特征主要是静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡性障碍，同时伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状，严重影响患者的生活质量。随着人口的老龄化，其发病率逐年上升，60岁以上人群患病率约1%[1-2]。PD发病机制目前未明确，其研究模型处在不断改进中。Betarbet等[3]建立的鱼藤酮帕金森病大鼠动物模型，具有选择性多巴胺能神经元受损、残存多巴胺能神经元内出现lewy小体、多巴胺能神经元进行性损伤等一系列帕金森病核心特征，受到帕金森病研究者的广泛重视。该模型的制作方法有颈静脉手术埋泵法[4]，长期低剂量皮下注射法[5-6]等，造模成本高，耗时长，成功率低，限制了它的应用与发展。

微球是指药物分散或吸附在高分子聚合物基质中形成的微小球状实体，具有长效缓释作用[7]。本实验采用乳化-溶剂挥发法，制备鱼藤酮微球，并对其质量进行考查，拟将其应用于PD大鼠造模，以期降低动物造模过程中给药频率，减小动物造模过程中的死亡率。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Mastersizer 3000粒度仪(英国马尔文公司)；EM-30PLUS扫描电子显微镜(韩国COXEM公司)；XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；B11-3型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SHY-3水浴恒温振荡器(金坛普林仪器制造有限公司)。

1.2 药品与试剂

鱼藤酮(陕西帕尼尔生物科技有限公司，批号160101)；乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA7525 4A，美国Lakeshore Biomaterials公司，批号LP733)；PVA(Mw：13000～23000，水解度：87%～89%，美国Sigma-Aldrich公司)；二氯甲烷(北京高纯科技有限公司，批号20160722)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD大鼠，雄性，200～250g，济宁医学院动物房提供，动物许可证号：SCXK(鲁)2014-0007，动物实验符合实验动物福利和动物伦理学要求。

2 方法与结果

2.1 鱼藤酮微球的制备

采用乳化-溶剂挥发法[8]制备鱼藤酮微球：精密称取适量鱼藤酮和PLGA，加入二氯甲烷，涡旋使之溶解为均匀透明的油相(O)溶液，将油相缓慢加入到含有1%PVA的水相(W)中，在2800r/min转速下通过高速分散器高速剪切2.5min形成O/W型乳液，后加入0.1% PVA水溶液中，继续低速搅拌4h，挥发有机溶剂，并固化微球。采用合适筛子收集微球，用纯化水洗涤3～5次后，真空干燥，得鱼藤酮微球。

2.2 微球形态、粒度分布检查

采用扫描电子显微镜(SEM)观察微球外观形态，并用激光粒度仪测定鱼藤酮微球粒径分布，结果见图1、图2。电镜扫描结果显示微球形态圆整，表面光滑。粒度测定结果显示，鱼藤酮微球平均粒径为9.58μm，径距为1.15。

图1 鱼藤酮微球扫描电镜照片(×1000)

图2 鱼藤酮微球粒径测量结果

2.3 鱼藤酮微球载药量和包封率的测定

2.3.1色谱条件 色谱柱：C18柱(200mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈：水为1∶1，检测波长：290nm，流速：1.0ml·min-1，柱温：30℃，进样量：100μl。

2.3.2标准曲线的绘制 精密称取鱼藤酮适量，配制一系列不同浓度的鱼藤酮二甲亚砜溶液。将样品溶液用微孔滤膜过滤后进HPLC测定，以峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程为：A=51374C+67941(R2=0.9999)，鱼藤酮在2.0～120mg·L-1范围内峰面积与浓度线性关系良好。

2.3.3载药量和包封率的测定 精密称取鱼藤酮微球10mg，溶解到5ml DMSO中，用流动相稀释定容后，进HPLC测定峰面积，并按以下公式计算载药量和包封率：

载药量(%)=微球中药物重量/微球总重量×100%

包封率(%)=微球实际载药量/理论投药量×100%

按照实验处方工艺，制备3批鱼藤酮微球，测得3批微球平均载药量和包封率分别为40.39%和85.72%。

2.4 鱼藤酮微球体外释放度测定

精密称取鱼藤酮微球适量置于50ml具塞离心管中，加入一定体积的释放介质，涡旋1min后放入37℃、50r·min-1恒温水浴振荡器中，分别于1、2、4、6、8、24h和2、3、4、5、6、7d取出离心管，室温下8000r/min离心3min。取10ml上清液作为供试液，并向原溶液中补充10ml释放介质，涡旋1min后放入振荡器中振荡。将供试液按“2.3.1”项下色谱条件进行进样测定，并计算累积释放度。见图3。

图3 鱼藤酮微球体外释放曲线

由于鱼藤酮难溶于水，因此，鱼藤酮微球在pH6.8磷酸盐缓冲液中的溶解过程极其缓慢，41d累积释放度仍不及10%，因此，我们参考相关文献[3]，将释放介质更改为pH6.8磷酸盐缓冲液和40%乙醇的混合溶液，在该混合溶液中，鱼藤酮微球释药平缓，第7天释药达到100%。

2.5 鱼藤酮微球体外释药机理探讨

为了研究鱼藤酮微球的体外释放规律，分别按零级释放、一级释放、Higuchi方程和Weibull分布模型对体外释放数据进行拟合。见表1。

表1 鱼藤酮微球在pH6.8PBS(含40%乙醇)中的体外释放拟合结果

体外释放度结果表明，鱼藤酮微球的体外释放行为更符合一级释放规律。

2.6 鱼藤酮微球诱导大鼠PD模型的建立

18只SD大鼠随机分为空白组、微球组和每日注射组，每组6只。实验周期为28d，给药方式为颈部皮下注射，剂量为2.5mg/kg/d。空白组和每日注射组每日固定时间分别给予生理盐水和鱼藤酮葵花油溶液，微球组于第1、8、15、22天给予微球混悬液。3组大鼠分别于给药后每隔4d称重，记录数据见图4，给药频率和死亡情况统计表见表2。

图4 3组大鼠的体重变化对比图

由图4可知，空白组大鼠体重增长率为28.57%，微球组和每日注射组体重增长率分别为11.20%、8.09%，提示微球给药方式对大鼠体重增长影响较小。

表2 大鼠PD造模死亡数量统计

微球组有1只大鼠于给药后第3天死亡，每日注射组有2只大鼠分别于给药后第6日和第8日死亡，由表2可知，微球给药显著降低了给药频率和造模死亡率。

实验过程中，给药的2组大鼠均在给药后出现动作迟缓、弓背状姿势，步态不稳等PD模型的典型特征。本实验过程中，按陈忻等[9]记分方法，微球组与每日注射组大鼠行为学记分均在3分以上，因此，进一步确认本文成功制备PD大鼠模型。

3 讨论

鱼藤酮是一种常见的线粒体复合体I抑制剂，具有较强的脂溶性，较易透过血脑屏障，从而具有多巴胺神经元的毒性。同时，鱼藤酮对于神经元的损伤是一个缓慢作用过程，能够使动物产生与帕金森病PD较为相似的症状，较好地模拟临床上PD发病慢、进行性发展的特点[10]。因此,被国内外学者广泛应用于制备帕金森病动物模型。

鱼藤酮见光易分解。因此，本实验操作中需尽量避光操作，也有学者尝试将其制备成为纳米脂质体和包合物来提高其稳定性，降低毒性并减小个体差异。本文成功制备了鱼藤酮微球，并将其进行了PD大鼠造模的初步研究。研究表明鱼藤酮微球用于PD大鼠造模可以降低给药频率，减小动物死亡率，造模动物出现了PD大鼠的行为学典型特征。但系统的病理学以及药物代谢动力学实验还有待于进一步研究。

[1] 苏娜,吴斌,徐珽.司来吉兰治疗帕金森病的有效性与安全性的系统评价[J].中国医院药学杂志,2014,34(14):1206-1212.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.14.17.

[2] 李子悦,尤浩军,孙志宏.环境和遗传因素在帕金森病中的作用[J].延安大学学报:医学科学版,2017,15(1):70-72.DOI:10.3969/j.issn.1672-2639.2017.01.024.

[3] Ranjita B,Sherer TB,Gillian MK,et al．Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’S disease[J].Nat Neurosci,2015,3(12):1301-1306.DOI:10.1038/81834.

[4] Sherer TB,Kim JH,Betarbet R,et a1.Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and a Synuclein aggregation[J].Exp Neurol,2003,179(1):9-16.DOI:10.1006/exnr.2002.8072.

[5] 张玉梅.长期低剂量皮下注射鱼藤酮制备多巴胺神经元损伤模型及其机制研究[D].大连：大连医科大学，2009.

[6] 马宝仓,陈忻.鱼藤酮帕金森病动物模型及毒性机制研究进展[J].中药药理与临床,2013,29(1):164-169.DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.2013.01.058.

[7] 周雪,薛雨晨,贺智勇,等.阿司匹林PEG-PLGA缓释微球的制备以及体外释药的考察[J].中国医院药学杂志,2014,34(22):1889-1893.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.22.03.

[8] 甘晶瑶,梁荣才,刘沙,等.Notel长效微球制剂的制备和评价[J].中国医院药学杂志，2016,36(14):1185-1189.DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2016.14.09.

[9] 陈忻,张楠,赵辉,等.鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(4):232-234.DOI:10.3969/j.issn.1002-0152.2008.04.011.

[10] 李亚南,毛全高.鱼藤酮纳米脂质载体及其修饰物在大鼠体内的分布[J].江苏大学学报(医学版),2016,26(4):346-351.DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.y160102.