谢利波， 刘敏， 王敏

我国是人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染的高发区，HCMV一旦侵入人体，将长期或终身存在于体内，在大多数免疫正常个体表现为无症状感染，但对于胎儿和婴儿却可出现明显症状[1]。HCMV感染的靶器官与宿主年龄密切相关，先天性宫内感染的胎儿会导致中枢神经系统损害和各种先天畸形等可能导致死亡的严重损害[2-3]。婴幼儿感染以肝炎、肺炎多见，较大儿童感染则多无症状[4]。由于HCMV感染缺少典型的临床症状，但其感染对于婴儿危害比较大，仅靠临床表现不能明确诊断，诊断HCMV感染主要依赖于实验室证据，包括病毒学检查或血清学检查结果的支持[4-5]。大部分医院目前没有开展基于病毒学原理的病毒分离培养方法诊断HCMV感染，而运用经典的酶联免疫吸附实验检测HCMV-IgM抗体的检出率低，特别是对于新生儿和幼小婴儿由于其产生IgM的能力弱，即使IgM阴性也不能排除HCMV感染的可能[4]。国内外研究显示，由于病毒DNA的出现通常早于病毒感染的临床症状或血清学反应，荧光定量PCR技术目前已成为了一种能早期、敏感地发现HCMV感染存在的诊断方法[6-7]。本研究通过分析婴儿HCMV-IgM抗体阴性情况下联合定量检测婴儿尿液及其母亲乳汁HCMV-DNA的荧光定量结果来探讨其在对婴儿HCMV感染诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月至2015年12月宜昌市中心人民医院儿科收治疑似HCMV感染患儿304例，其中男150例，女154例；年龄2 d至12个月，平均(99.3±44.8)d。根据患儿主诉及体格检查、临床第一诊断将疑似HCMV感染患儿分为肝炎组186例、肺炎组71例及其他组(主诉为发热、腹泻等)47例。肝炎组中男100例，女86例；年龄2 d至4个月，平均(73.0±55.6)d。肺炎组中男31例，女40例；年龄30 d至7个月，平均(113.0±48.7) d。其他组中男19例，女28例；年龄50 d至12个月，平均(98.0±58.9) d。3组患儿在性别、年龄方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入标准 (1)患儿为母乳喂养；(2)年龄为1岁以内；(3)巨细胞病毒抗体IgM的血清学检测结果为阴性。

1.3 排除标准 患儿近1个月已使用抗巨细胞病毒药物如阿昔洛韦、更昔洛韦等。

1.4 方法

1.4.1 标本采集 初诊的第2天上午用无菌试管分别留取婴儿尿液及其母亲的母乳及时送检，不能及时送检的暂时储存于4 ℃冰箱中。

1.4.2 检测方法 所用7300型荧光定量PCR仪(美国ABI)，试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。荧光定量PCR检测HCMV-DNA按试剂说明书操作，乳汁及尿液离心后用生理盐水洗涤沉淀，12 000 r/min离心5 min后去上清，往沉淀中加DNA提取液50 μL混匀后置于100 ℃金属浴10 min，12 000 r/min离心5 min后取5 μL做模板进行定量PCR扩增。

1.4.3 结果判断 HCMV-DNA的标准曲线呈典型的S曲线且标本定量结果>500拷贝/mL为阳性，否则为阴性。所有实验数据在阴、阳对照均在控的情况下获得。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，多组计数资料两两比较采用bonferroni法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同疾病组HCMV-DNA检出率比较 见表1。

表1 3组患儿尿液及母乳HCMV-DNA检出率比较[n(%)]

表1结果表明，肝炎组和其他组尿液HCMV-DNA检出率显著低于母乳，差异有统计学意义(P<0.05)。肺炎组尿液HCMV-DNA检出率与母乳比较差异无统计学意义(P>0.05)。3组间尿液和母乳中HCMV-DNA检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同年龄患儿尿液及母乳HCMV-DNA检出率比较 见表2。

表2 不同年龄患儿尿液及母乳HCMV-DNA检出率比较[n(%)]

表2结果表明，年龄<90 d患儿尿液HCMV-DNA检出率显著低于年龄90～180 d和>180 d患儿，差异有统计学意义(P<0.05)；年龄90～180 d和>180 d患儿尿液HCMV-DNA检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)；不同年龄患儿乳汁HCMV-DNA检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 不同标本类型检出阳性率 见表3。检出尿液与乳汁同时阳性88例(28.95%)，乳汁阳性174例(57.24%)，尿液阳性141例(46.38%)。

表3 乳汁/尿液HCMV-DNA检测阴、阳性例数(n)

3 讨论

HCMV感染性很强，致病性却不是很强，易被宿主抑制而不对机体造成严重的持久损害。由于婴儿免疫功能不完善，阻止HCMV入侵的能力较弱，故极易受感染。婴儿感染后多数可能有不同程度的肝胆受损[4]，少数婴儿感染后会发生间质性肺炎。本研究也提示，感染巨细胞病毒患儿中肝炎组例数最多且其平均年龄最小，同时尿液及母乳双阳性中有50%出自肝炎组，提示肝脏可能是婴儿期极易受到巨细胞病毒感染的器官。

我国温州地区的一项研究结果显示，该地区住院患儿HCMV-IgG阳性率达83%，而1岁以内患儿HCMV-IgG阳性率仅64.1%，且<28 d患儿IgM阳性率仅1%[8]，主要由于婴儿免疫力低，产生IgM的能力较弱，故假阴性多。目前荧光定量PCR技术已经成为一种获得公认的快速、高特异性和灵敏度的临床辅助诊断技术[9-12]。荧光定量PCR技术通过检测巨细胞病毒DNA载量，使其成为了一种能早期、敏感地发现巨细胞病毒感染存在的诊断方法[13]，特别在HCMV-IgM阴性的情况下尤其试用。由于巨细胞病毒任何年龄小儿体内HCMV活动复制时，都会在肾脏进行，产生病毒尿症，却无明显的泌尿系统感染表现[5]。处于活动性HCMV感染期的母亲乳汁是婴儿后天感染HCMV的一个重要途径。由于尿液及乳汁取材方便容易，可重复检测用于疗效监测，成为临床常用的检测标本。

既往研究多集中在早期、多种方法联合检测巨细胞病毒感染，而此文设定在特定的情况下，即高度怀疑巨细胞病毒感染但无确切巨细胞病毒现症感染的证据(HCMV-IgM阴性)时，联合尿液及乳汁行巨细胞病毒DNA检测。此研究发现，尿液检出阳性率为46.38%，略高于韩剑英等[14]报道的41.74%，考虑一方面可能与现今市场上荧光定量PCR检测产品的不断技术改良有关，另外一方面也可能与病例纳入标准不完全一致有关。

翁玉英等[15]对不同标本进行HCMV-DNA检测，发现婴儿尿液及乳汁阳性率均显著高于淋巴细胞，且母乳阳性率与尿液及淋巴细胞阳性率、HCMV-IgM阳性率均显著正相关，提出联合检测有助于辅助诊断。沈丹等[16]对3种标本进行HCMV-DNA检测，提出3次混合尿标本检出率最高，朱艳萍等[17]和Choudhary等[18]则提出进行尿液HCMV-DNA联合血清HCMV-IgM检测以提高阳性率。由此可见，尿液及乳汁的HCMV-DNA检测越来越受到广大儿科医生的关注。此研究结果也显示患儿母乳中HCMV-DNA阳性率均高于50%以上，提示母乳是重要的潜在传染源，对于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制剂的患儿，有必要预防感染。本研究总共有304例患儿，由于新生儿不足10例，未单独统计。对于高度怀疑而血清CMV-IgM检测结果为阴性的，最好能同时检测HCMV-DNA及抗HCMV抗体，提高检出率。既往认为HCMV-DNA阳性只能表示感染却不能区分产毒感染或潜伏感染[4-5]，但近期随着研究的深入和完善，有研究表明高HCMV-DNA载量提示活动性HCMV感染[11]，更多研究者提出了联合检测及肯定了尿液HCMV-DNA检测对于婴幼儿巨细胞病毒感染的诊断价值[14-18]。但不能证明与临床感染疾病有直接关系，结合临床，只能推测。

此研究中304例患儿母乳与尿液HCMV-DNA双阳性88例，双阴性77例，双阴性中有54例来自平均年龄最小的婴儿肝炎综合征组，且后续复查结果证实有尿液HCMV-DNA阳性或CMV-IgM阳性，说明尿HCMV-DNA载量明显增高可以用作活动性病毒感染的指标。年龄较小的患儿的感染主要来自母亲，且由于婴儿免疫力不完善和HCMV排毒具有间歇性的特点，容易漏检，对于高度怀疑患儿可考虑需隔段时间复查HCMV-DNA和CMV-IgM或按照沈丹等[16]的方法取3次混合尿标本进行检测。

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