向丽，王沛明，胡樱凡，王平，孟宪丽

内毒素血症是由细菌内毒素（LPS）进入血液后引发的一系列生理病理改变，严重时甚至危及生命。研究表明LPS进入机体后，经过一系列的炎症反应最终导致炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量释放，这些炎症因子的大量释放又会进一步加重炎症反应，造成机体的炎性损伤[1]。

大黄-黄芩作为方剂中的经典药对，两者合用泻火解毒，多用于热毒证的治疗。现代研究表明大黄、黄芩单味药对炎症和内毒素血症有良好的缓解和改善作用[2]，然而有关二者配伍使用的相关研究却报道较少。本研究拟通过建立内毒素血症大鼠模型，观察大黄黄芩配伍后对LPS诱导的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO影响，初步探讨大黄-黄芩配伍后对内毒素血症大鼠的保护作用及作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠50只，体重200～240 g。由四川成都达硕科技有限公司所提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-24。饲养于成都中医药大学中医脏腑病症实验室动物房（22±3℃，40% ～70%），SPF级，动物使用许可证号：SCXK（川）2012-179。

1.2 药物与试剂

大黄与黄芩药材购自北京本草方源药业有限公司，经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定分别为药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根。LPS（美国Sigma公司，Ecoli O55:B5）； TNF-α ELISA 试剂盒（上海依科赛科技股份有限公司，批号141202）；IL-1β ELISA 试剂盒（上海依科赛科技股份有限公司，批号：141202）；IL-6 ELISA试剂盒（上海依科赛科技股份有限公司，批号：141128）；NO测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：141024）。

1.3 仪器

D-37520低温高速离心机（ThermoFisher）；Varioskan 全波长多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 药对水提物制备

大黄黄芩药对配伍比例依据源于经典方三黄泻心汤中的大黄黄芩2:1的配比。准确称取大黄30 g、黄芩15 g，加水约300 mL，浸泡0.5 h，用武火煎至沸腾后改用文火煎40 min。倾出药液，加水约240 mL再煎25 min。合并药液浓缩至100 mL，得0.45 g(生药)/mL，置4 ℃ 冰箱保存备用, 于给药前用蒸馏水以1∶0.5的倍比稀释成0.45 g(生药)/mL 和0.225 g(生药)/mL。地塞米松片（阳性药）用蒸馏水稀释成0.75 mg﹒mL-1。

2.2 给药、造模及取样

雄性SD大鼠50只，适应性饲养1周后，随机分为5 组，每组10只，分别为空白组、模型组、地塞米松组、4.5和2.25 g﹒kg-1大黄-黄芩药对组。各给药组动物灌胃预防性给药连续7 d，每日早晚各1次，空白组和模型组给予等体积的蒸馏水。末次给药前禁食不禁水8 h，末次给药结束后，除空白组外各组大鼠经尾静脉注射5 mg﹒kg-1LPS建立内毒素血症模型，空白组注射等体积的生理盐水。大鼠注射LPS 6 h后，用20% 乌拉坦（1.0 g﹒kg-1体重）进行麻醉，股动脉取血，室温放置半小时后，以3500 rpm离心15 min，分离上层血清并分装保存于-80℃超低温冰箱，待检。

2.3 ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量

采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书的操作步骤检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

2.4 化学比色法检测血清中NO的含量

采用化学比色法，严格按照测试盒说明书的操作步骤检测大鼠血清中NO的含量。

2.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，数据以x±S表示，组间显著性差异采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 大黄-黄芩药对对内毒素血症模型大鼠血清中TNF-α的影响

由表1可知，与空白组比较，模型组大鼠血清中TNF-α的含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，4.5 g﹒kg-1大黄-黄芩药对组可显著降低模型大鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。

表1 大黄黄芩药对对内毒素血症模型大鼠TNF-α的影响(x±S，n=10)

3.2 大黄-黄芩药对对内毒素血症模型大鼠血清中IL-1β的影响

由表2可知，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β的含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，4.5和2.25 g﹒kg-1大黄-黄芩药对组可显著降低模型大鼠血清中IL-1β的含量（P＜0.05）。

表2 大黄黄芩药对对内毒素血症模型大鼠IL-1β的影响(x±S,n=10)

3.3 大黄-黄芩药对对内毒素血症模型大鼠血清中IL-6的影响

由表3可知，与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-6的含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，4.5和2.25 g﹒kg-1大黄-黄芩药对组可明显降低模型大鼠血清中IL-6的水平（P＜0.05）。

表3 大黄黄芩药对对内毒素血症模型大鼠IL-6的影响(x±S,n=10)

注：与模型组比较，* P＜0.05，**P＜0.01

3.4 大黄-黄芩药对对内毒素血症模型大鼠血清中NO的影响

由表4可知，与空白组比较，模型组大鼠血清中NO的含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，4.5和2.25 g﹒kg-1大黄-黄芩药对组可明显降低模型大鼠血清中NO的水平（P＜0.01或P＜0.05）。

表4 大黄黄芩药对对内毒素血症模型大鼠NO的影响(x±S,n=10)

4 讨论

内毒素血症是由LPS入侵机体后引起的一类综合性疾病，严重时甚至危及生命[3]。LPS进入机体后，经过一系列的炎症反应最终导致炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的大量释放，这些炎症因子的大量释放反过来又会进一步加重炎症反应，造成机体的炎性损伤[4]。因此，通过抑制炎症因子的释放，是治疗内毒素血症的有效途径之一。

大黄-黄芩是方剂中的经典药对之一，两者合用泻火解毒，多用于的热毒证的治疗。研究发现大黄素可通过阻断NF-κB炎症通路，来减少炎症因子的释放达到缓解内毒素血症的作用[5～6]。大黄酸也可通过抑制IκBα降解和p65蛋白的转位来减少炎症因子的分泌[7]。黄芩苷可减少炎症因子的释放[8]。黄芩素亦可抑制TNF-α、IL-6等炎症因子的释放[9]。现代研究表明，中医热毒证证型与内毒素血症初期症状相似。因此大黄-黄芩药对可用于内毒素血症初期的治疗。

本次实验结果表明大黄-黄芩药对能不同程度地减少内毒素血症模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的释放。研究表明过量表达的TNF-α可损伤内皮细胞和组织，诱导其他炎症细胞因子表达，进一步刺激炎症反应[10]。IL-1β和IL-6是白细胞介素的重要成员，机体组织内IL-1β和IL-6水平的过量升高能诱发多种炎性疾病[11～12]。NO是内毒素血症中的重要炎症介质，过量的NO也可促进炎症反应的加剧以及多种炎症因子的进一步释放[13]。因此，抑制机体内TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的产生对于炎性疾病的治疗和控制具有重要的意义。大黄-黄芩药对对TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的抑制作用表明其具有良好的保护炎症的作用。提示大黄黄芩配伍使用改善内毒素血证炎性损伤的作用机制可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平来实现的。

综上所述，大黄-黄芩配伍后对内毒素血症模型大鼠的炎性损伤有较好的保护作用，其作用机制可能是通过抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放来实现的。

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