董维鹏 王君实 张少华 燕炯

（山西医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，太原 030001）

1987年，日本微生物学家石野良纯偶然间发现了细菌中存在某种异常重复序列［1］，到2012年，Jinek 等［2］首次在体外用sgRNA（single guide RNA）引导Cas9（CRISPR-associated，Cas）蛋白对DNA进行切割，证实采用规律成簇的间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）系统进行基因编辑的可行性，从此拉开了CRISPR/Cas9系统蓬勃发展的序幕。到今天为止，有关CRISPR/Cas9技术的研究越来越多，该系统的结构、原理、功能已经逐渐的清晰明了，其应用也不仅局限在微生物，适用范围已经扩展到植物细胞、动物细胞、动物基因组编辑等方面，而且在临床上也已经有了成功的案例。作为新一代的基因编辑工具，CRISPR/Cas9系统拥有其他编辑工具不可比拟的优势，其应用范围广，经济可行，容易操作，有望成为未来主要的基因编辑工具。

1 CRISPR系统研究进展

1.1 CRISPR系统的作用原理

CRISPR系统源自于细菌、古细菌，是原核生物中用来防御质粒、病毒等核酸入侵而建立的自身免疫系统［3］。目前根据核酸剪切酶的功能和序列的不同将CRISPR系统分为不同亚型［4］，其中CRISPR/Cas9系统是目前应用最为广泛的系统。在原核生物中，CRISPR/Cas9系统由CRISPR基因座、Cas9蛋白和tracrRNA（Transactivating crRNA）构成，其中CRISPR基因座由前导区序列（Leader）、串联重复序列（Repeats）和间隔序列（Spacers）组成［5］。前导区序列长300-500 bp，位于基因座上游，该序列没有开放阅读框，且在同一物种间高度保守［6］；重复序列同样高度保守，具有稳定的茎-环结构，长度一般在23-50 bp［7］；间隔序列是该系统中起关键作用的序列，它转录出一段crRNA（CRISPR-derived RNA），成熟的crRNA识别外源靶序列，引导具有切割活性的Cas9蛋白与外源靶序列结合发挥切割功能。……