吴 娴，周湘红，苏 莉，安邦权，黄盛文

(1.贵州省临床检验中心，贵阳 550002；2.贵州省人民医院检验科，贵阳 550002； 3.贵州省人民医院输血科，贵阳 550002)

血友病A(hemophilia A，HA)是由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷而引起的一种X-连锁隐性遗传性出血性疾病。由于FⅧ基因突变呈高度异质性，对HA患者及携带者只靠直接基因诊断，操作繁琐、工作量大、耗时长、费用昂贵[1-2]，基于DNA多态性标志位点进行连锁分析的间接基因诊断仍然是临床上用于HA基因诊断的常用方法。常用于HA间接基因诊断的多态位点有BclⅠ、HindⅢ、St14(DXS52)和XbaⅠ等[3-5]，但每个位点的诊断率有限，并且在不同地区不同人群中的诊断率有所差异。为寻找新的可用于本地人群HA基因诊断的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)，本文对FⅧ基因内5个亚洲人群中杂合度较高的SNP位点的多态性进行分析，并将在本地人群中具有多态性的位点用于HA家系的间接基因诊断，评价其对HA基因诊断的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 2012年6月至2014年10月，在贵州省人民医院及贵州省血友病协会收集到16个无血缘关系的HA家系，家系成员共59名，先证者均为男性，年龄范围5个月至45岁。根据HA诊断标准[6]，16例先证者中3例为重型，9例为中型，4例为轻型。另选取50例汉族健康女性用于SNP位点多态性分析，其年龄范围21～59岁。

1.2方法

1.2.1SNP位点和酶切位点选取及引物设计 通过检索UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)，按照在亚洲人群中杂合度较高且只具有二等位基因的条件筛选出5个SNP位点(rs1509787、rs1800291、rs3861554、rs1470586、rs6649625)。5个位点在FⅧ基因内的位置见图1(图中每1条竖线代表1个外显子)。将SNP位点所在的DNA片段序列输入WatCut在线软件(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)确定酶切位点，并进行限制性内切酶的选择。使用primer3.0在线软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物PCR引物(表1)。

图1 5个SNP位点在FⅧ基因内的位置

1.2.2PCR扩增及酶切分析 5个SNP位点的PCR反应总体积为25 μL，反应体系包括：模板DNA 100 ng，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，dd H2O 8.5 μL。反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共 30 个循环；最后72 ℃延伸5 min。酶切反应总体积为20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR产物 10 μL，限制性内切酶 2 μL，dd H2O 6 μL。样品加好后，位点rs1509787、rs1800291、rs3861554、rs6649625置37 ℃水浴箱内酶解过夜。位点rs1470586置55 ℃水浴箱内酶解1 h。取10 μL酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像观察电泳结果。

表1 5个SNP位点信息及酶切分析

F：上游引物，R：下游引物

1.2.3测序验证 用PCR-RFLP方法检测50例健康女性标本，随机选取各SNP位点不同基因型样本各2例，将其PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行测序，测序结果采用Chromas软件进行分析，将测序结果与PCR-RFLP检测结果进行比对。

1.2.4HA家系连锁分析 选取在本地人群中具有多态性的SNP位点，检测各家系成员的基因型。当先证者母亲为多态位点的杂合型时，根据先证者及其母亲的基因型，判断出与致病基因连锁的等位基因，据此对家系中的其他成员是否为患者或携带者做出诊断。

1.3统计学处理 采用的SPSS20.0软件进行数据分析。计数资料采用率表示，通过直接计数对SNP位点基因型和等位基因频率进行计算；采用χ2检验计算基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡；SNP位点多态信息量采用PIC-Calc6.0软件(http://www.bbioo.com/download/58-247-1.html)计算。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.15个SNP位点多态性分析 50例健康女性中，rs1800291和rs6649625两个位点均为纯合型，其基因型分别为GG和TT；rs1509787、rs3861554、rs1470586 3个位点均具有多态性。其中，rs1509787检出CC和CT两种基因型，rs3861554检出GG、AG和AA 3种基因型，rs1470586检出GG、AG和AA 3种基因型。PCR-RFLP方法检测结果与测序结果一致(图2～4)。rs1509787、rs3861554、rs1470586位点的等位基因和基因型频率见表2，等位基因和基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P=0.651 7、0.775 9和0.780 0)。3个位点的杂合子频率与UCSC数据库提供的杂合子频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。这3个SNP位点的多态信息量分别是0.106 4、0.344 4和0.310 8。

A：酶切电泳图(M：5 000 bp DNA Marker；1、4：杂合子CT；2、3、4：纯合子CC)；B：CC、CT基因型测序图

图2 rs1509787位点酶切后电泳图及测序结果

A：酶切电泳图(M：5 000 bp DNA Marker；11、16：纯合子AA；12、14、15：纯合子GG；13：杂合子AG)；B：AA、GG、AG基因型测序图

图3 rs3861554位点酶切后电泳图及测序结果

A：酶切电泳图(M：5 000 bp DNA Marker；1、4：纯合子AA；3：纯合子GG；2、5、6：杂合子AG)；B:AA、GG、AG基因型测序图

图4 rs1470586位点酶切后电泳图及测序结果

2.23个SNP位点用于HA家系的间接基因诊断

表2 rs1509787、rs3861554和rs1470586位点等位基因及基因型频率

3个SNP位点可对16个家系中的7个家系做出间接基因诊断，家系的诊断率为43.8%。rs1509787可为2个家系提供诊断信息，rs3861554可为5个家系提供诊断信息，rs1470586可为1个家系提供诊断信息，家系诊断率分别为12.5%、31.5%和6.25%。其中，有1个家系可同时由rs1509787和rs1470586提供诊断信息。

3 讨 论

利用FⅧ基因内和基因外的DNA多态性标记对HA进行间接基因诊断具有简便、价廉的优点，但同一位点在不同的文献报道中诊断率差异较大。BclⅠ对中国人的HA诊断率为27.8%～50%[4,7]，国外文献报道的诊断率为46.3%[8]。HindⅢ对中国人的HA诊断率为37.5%[4]，在北印度人群中的杂合率为38%[9]。Stl4(DXS52)的诊断率相对较高，可达70%以上[10]，但该位点与FⅧ基因的相对距离为2cM，有2%的重组可能。本课题组对16个血友病A家系的研究表明，BclⅠ和Stl4(DXS52)对HA的诊断率分别为12.5%和25.0%，而HindⅢ未能提供诊断信息[11]，与文献报道有较大差异。因此，有必要寻找新的适合于本地人群的多态位点用于HA间接基因诊断[12]。

本研究结果显示5个FⅧ基因内的SNP位点中，rs1800291及rs6649625均为纯合型，与UCSC数据库提供的数据不相符，这说明不同地区和人群的多态位点杂合度会有所不同。因此，对所选人群而言，这两个位点不具有诊断价值。rs1509787、rs3861554及rs1470586均具有多态性，测序结果与PCR-RFLP方法检测结果一致。3个位点的等位基因及基因型频率与UCSC数据库提供的数据比较差异无统计学意义(P>0.05)，基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡检验，多态信息量分别为0.106 4、0.344 4、0.310 8。

本研究检测的16个家系中有7个家系可利用这3个具有多态性的SNP位点提供诊断信息，总的家系的诊断率为43.75%(7/16)，其中有5个家系可以用rs3861554位点提供诊断信息，2个家系可以用rs1509787位点提供诊断信息，1个家系可以用rs1470586位点提供诊断信息。因此，本研究所选的3个SNP位点具有临床诊断价值，尤其是rs3861554的多态信息量较大，诊断率较高，可作为本地人群HA诊断的常用多态位点。这3个位点是否对其他人群具有诊断价值，还需要作进一步的验证。联合运用上述几个多态位点仍有部分家系不能做出诊断，还需要继续寻找更多适合于本地人群HA诊断的多态位点。

[1]郑天津，黄蓉，赵胜科，等．甲型血友病家系的直接和间接基因诊断[J]．中国优生与遗传杂志，2016，24(5)：38-43．

[2]黄蓉，曹颖，郑天津，等．血友病A家系的单体型基因连锁分析[J]．温州医科大学学报，2016，46(7)：482-489．

[3]赵胜科，郑天津，陈靖，等．甲型血友病家系的STR-PCR和PCR/RFLP单体型连锁基因诊断[J]．中国优生与遗传杂志，2014，22(10)：36-41．

[4]乔秀强，李燕平，曾蕾，等．Bcl I和HindⅢ位点在家系性血友病A基因诊断的意义[J]．中国实验血液学杂志，2011，19(1)：189-192．

[5]刁戈，马莉，林方昭，等．LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用[J]．中国输血杂志，2013，26(1)：33-36．

[6]中华医学会血液学分会血栓与止血学组．中国血友病协作组.血友病诊断与治疗中国专家共识(2013年版)[J]．中华血液学杂志，2013，34(5)：461-463．

[7]刘元方，王学锋，储海燕，等．血友病A携带者检测与产前诊断[J]．中华医学杂志(英文版)，2002，115(7)：991-994．

[8]CHOWDHURY M R,TIWARI M,KABRA M,et al.Prenatal diagnosis in hemophilia A using factor VIII gene polymorphism--Indian experience[J].Ann Hematol,2003,82(7):427-430.

[9]TASLEEM RAZA S,HUSAIN N,KUMAR A.Screening for hemophilia A carriers:utility of PCR-RFLP--based polymorphism analysis[J].Clin Appl Thromb Hemost,2009,15(1):78-83.

[10]闫梅，梁燕，陈星，等．DXS52(St14)在血友病甲基因诊断中的方法改进及应用[J]．中华医学遗传学杂志，2011，28(1)：19-22．

[11]吴娴，周湘红，安邦权，等．贵州地区血友病A基因诊断[J]．临床血液学杂志，2016，29(5)：755-757．

[12]DAI J,LU Y,DING Q,et al.The status of carrier and prenatal diagnosis of haemophilia in China[J].Haemophilia,2012,18(2):235-240.