邓志博，何施逸，王乾力，李韫韬，胡乔莉，杜永洪

(重庆医科大学生物医学工程学院省部共建国家重点实验室培育基地-重庆市超声医学工程重点实验室/重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016)

黄褐斑的形成主要是因为黑色素细胞的活性及功能增强和黑色素颗粒的明显增多[1]，其中以基底层和棘层最为明显。黑色素细胞活性增强的原因尚不清楚，推测与内分泌的失调、紫外线辐照、氧自由基、遗传因素、子宫卵巢疾病、血清酮含量及情绪等有关[2-3]。无疗效确切的中西医治疗方案[3-5]。目前，黄褐斑动物建模的方法有雌激素全身攻击法、紫外线照射法和微量定点注射辅以紫外线照射法、黄体酮+紫外线+慢性应激抑郁法等[6-7]。本文根据致黄褐斑的内分泌失调与紫外线照射两个假说，比较分析肌内注射黄体酮和紫外线照射两种方法建立SD大鼠黄褐斑模型的优缺点。

1 材料与方法

1.1实验动物 28只SD大鼠，雌性，体质量(270±30)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，SPF级。

1.2仪器与试剂 窄谱311紫外线灯(深圳市可立士光电设备厂，型号：CLS-UV)；黄体酮注射液(1 mL∶20 mg，天津金耀药业有限公司，国药准字：H120233)；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法，96T,南京建成生物工程研究所，生产批号：20160630)；丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法,96T，南京建成生物工程研究所，生产批号：20160628)。

1.3方法

1.3.1实验动物分组 将28只雌性SD大鼠分为5组：对照组6只、高剂量黄体酮组6只、低剂量黄体酮组6只、高剂量紫外线组5只、低剂量紫外线组5只。

1.3.2建模 高、低剂量黄体酮组于每日14:00-16:00分别在SD大鼠大腿根部肌内注射黄体酮注射液25 mg/kg、10 mg/kg，两侧大腿左右交替注射，共30 d。对照组注射等量的生理盐水。高、低剂量紫外线组于每日14：00-15:00分别用311UVB紫外线辐照60、30 min，辐照高度距脱毛后的皮肤表面均为30 cm，辐照面积为20×30 cm2，共14 d。

1.3.3皮肤、肝脏组织匀浆的制备 紫外线组于第15天、黄体酮组于第30天处死大鼠，腹主动脉取血，后取皮肤、肝脏组织用预冷生理盐水(4 ℃)冲洗干净，于实验室配制成浓度为5%的组织匀浆待测。

1.3.4皮肤斑块形成的计算 采用网格肉眼计数估算。网格大小为每格1 mm，中间去掉，只余网线，将大鼠麻醉去毛后置于大鼠背部皮肤计数，每组取平均值。

1.3.5检测组织匀浆中SOD、MDA水平 将不同组织上清液稀释成相应的浓度后按测试盒说明书要求操作。

1.3.6检测皮肤病理黑色素颗粒沉着 取大鼠病变皮肤固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。

2 结 果

2.1不同时间肉眼观察病变大小情况 在建模第7天高、低剂量紫外线组SD大鼠背部皮肤已经基本可以看见色素斑块形成，且高剂量组比低剂量组明显，但黄体酮组变化并不明显。在建模的第14天高剂量黄体酮组已经基本可以看见少量的色素沉积，但低剂量组几乎无变化，高、低剂量紫外线组色素沉着明显但差异无统计学意义(P>0.05)。建模组与未建模组在第28天肉眼可见明显区别，见图1、2。

图1 不同时间斑块面积变化趋势

A:未建模组第28天；B:高剂量黄体酮组建模第28天；C:低剂量紫外线组建模第14天；D:高剂量紫外线组建模第14天

图2各组大鼠皮肤变化情况

2.2血清、肝脏组织、皮肤组织中SOD及MDA水平 与对照组比较，高剂量黄体酮组大鼠MDA水平升高、SOD水平降低，低剂量黄体酮组大鼠血清与皮肤组织中的SOD水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量紫外线组大鼠血清和皮肤组织中的SOD水平降低、MDA水平升高，低剂量组紫外线的大鼠皮肤组织中的SOD水平降低(P<0.05)，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠皮肤组织、肝脏组织、血清中SOD及MDA水平变化

图3 高剂量黄体酮组HE染色(×100)

图4 低剂量黄体酮组HE染色(×100)

2.3皮肤病理学变化观察 光学显微镜下，对照组偶见少量黑色素颗粒沉着，建模组可见黑色素颗粒显著成团堆积形成黑素小体。其中高剂量黄体酮组个体间黑色素颗粒沉着杂乱，多数呈层状密集排列，偶见少量色素呈单线型排列，见图3；低剂量黄体酮药物组大多呈单线型散在分布，见图4；高、低剂量紫外线组无明显的差异，呈线性排列，见图5、6。

图5 高剂量紫外线组HE染色(×100)

图6 低剂量紫外线组HE染色(×100)

3 讨 论

根据黄褐斑的发生与内分泌有关及目前学术界流行的“雌激素和黄体酮增多进而刺激黑色素细胞而致色素沉着”的学说[8]，采用肌内注射黄体酮(孕激素)的方法使大鼠的内分泌失调，间接的测量SOD和MDA来反映机体的氧化/抗氧化平衡[9]。本研究采用25 mg/kg和10 mg/kg的黄体酮肌内注射大鼠，高剂量黄体酮组大鼠MDA水平升高、SOD水平降低，低剂量黄体酮组大鼠血清与皮肤组织中的SOD水平降低。肌内注射药物作为一种全身用药，其不稳定性太大，个体差异较大，不可控因素太多。其次，判断黄褐斑形成的最直接、最客观的办法是皮肤病理组织检查黑色素颗粒的沉着，其多位于表皮的基底层与棘层。高剂量黄体酮组的大鼠皮肤病理组织可见位于基底层和棘层的层状密集排列的黑色素颗粒形成黑素小体，而低剂量黄体酮组的黑色素颗粒大多则是散在分布。由此可知，肌内注射高、低剂量的黄体酮建立黄褐斑大鼠模型在生物化学、病理学指标方面都有差异。

第二届理疗和光生物学大会提出[10-11]，UVB是光谱为275～320 nm的紫外线，其生物效应十分活跃，于紫外线下20～30 min可使皮肤晒伤变红，长期暴露局部皮肤，色素沉着明显,加速皮肤老化过程[12]。中波紫外线使黑素细胞增多进而黑色素生成增多[13]，作为一种外源性刺激作用于大鼠，黑色素颗粒增加，并形成黑色素小体，从而形成黄褐斑[12]。本实验用中波紫外线刺激从而建立黄褐斑大鼠模型，设置了高低剂量两个组，分别辐照30 min和60 min，结果显示高低剂量组之间无明显差异，建模第14天后大鼠背部皮肤均可见色素沉着，血清、肝脏组织、皮肤组织的SOD水平降低(P<0.05)，MDA升高(P<0.05)，变化幅度无明显差异，大鼠皮肤病理组织检查均可见位于基底层和棘层的单线型密集排列的黑色素颗粒。

综上所述，中波紫外线相对于黄体酮建模而言具有快速、高效、个体差异小、操作简单等优点。

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