刘妍，张凯，陈容娟，李奇，许智慧，思兰兰，蔺淑梅，徐东平

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是威胁人类健康的全球性问题。目前各相关指南将血清HBsAg消失或转换作为HBV临床治愈的主要指标之一[1-3]，然而HBsAg阴性也见于隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，即通过现有技术检测血清HBsAg阴性，但血清和(或)肝组织HBV DNA阳性的一种特殊HBV感染状态[4]。近年来研究证实OBI与HBV漏诊、肝脏疾病进展、输血传播、再激活及疫苗接种失败等密切相关[4-9]。OBI发生机制尚未完全阐明，目前研究认为与HBV S基因区突变有关[6,10-11]。HBV S基因编码由226个氨基酸(aa)残基组成的主蛋白即HBsAg，其主要亲水区(MHR，aa99-169)尤其MHR区的“a”决定簇(aa124-127)是抗-HBs中和抗体结合的表位，对HBsAg抗原性具有重要意义[11]。MHR区内发生aa替换、插入或缺失突变，可能会引入N-糖基化突变，即在原有s146-148NCT N-糖基化位点基础上，增加NXT/S(X为P以外的任何aa残基)新N-糖基化位点。我国学者于德敏等[12]研究认为MHR区N-糖基化突变可降低抗-HBs与HBsAg的亲和力，引起免疫逃逸。本研究对2例OBI患者S基因MHR区检出的4种N-糖基化突变形式(其中M1－M3为新型突变)，分析其抗原性以及与多种HBsAg临床检测试剂反应性，以期揭示S基因N-糖基化突变与OBI的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本实验室前期从2例OBI患者S基因MHR区检出的4种N-糖基化突变，分别为：aa115-116“INGTST”插入突变(M1)、aa126-127“RPCMNCTI”插入突变(M2)、aa113-118 TSTTST→NST+aa131-133 TSM→NST突变(M3)和sQ129N(M4)，1例发生M1、M2和M4突变，1例发生M3突变，M1－M3为本课题组首次发现的新型突变。本研究采用前期构建成功的野生型及突变型pcDNA3.1(-)/myc-His A-HBsAg重组质粒[13-14]，用于表达HBsAg-myc-His融合蛋白。本研究经解放军302医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 主要试剂 真核表达载体pcDNA3.1(-)/myc-His A购自美国Invitrogen公司；转染质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；X-tremeGENE HP转染试剂购自德国Roche公司；DMEM培养基购自美国HyClone公司；去糖基化酶PNGase F购自美国NEB公司；HRP标记的His、未标记His及myc标签蛋白小鼠单克隆抗体，HBsAg马多克隆抗体和HRP标记的抗马二抗购自美国Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自北京全式金公司；Super Signal West Pico化学发光液购自美国Thermo Fisher公司；免疫荧光染色专用8孔腔室载玻片购自德国Ibidi公司；Cy3标记的山羊抗小鼠二抗购自北京康为世纪公司；DyLight650标记的山羊抗马二抗购自美国Bethyl公司；细胞核染液DAPI购自北京碧云天公司；HBsAg检测采用德国Roche公司Elecsys定量及定性试剂。美国Alpha Diagnostic International(ADI)、美国Bio-Rad、北京万泰和上海科华4个公司的ELISA试剂盒，4种试剂均通过国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准用于临床检测。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养和转染 本研究采用HepG2、Huh7肝癌细胞系。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞传代培养至最佳状态，HepG2细胞按4×105/孔接种至6孔板，Huh7细胞按4.5×104/孔接种到8孔腔室载玻片；培养约20h后用X-tremeGENE HP转染试剂将pcDNA3.1(-)/myc-His A重组质粒按2.5:1比例(转染试剂:重组质粒)转染，48h或72h后处理，进行后续实验。

1.3.2 Western blotting分析突变融合蛋白 转染48h后收集HepG2细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，离心后吸取上清，将同一份样品分为2份，一份用沸水煮10min使蛋白充分变性，一份用去糖基化酶PNGase F按说明书去糖基化处理；融合蛋白变性样品及去糖基化后样品分别用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭后用抗-His标签蛋白小鼠单克隆抗体(稀释比例1:1000)为一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记山羊抗小鼠二抗(1:2000)室温孵育2h，发光液显色，在Tanon5200全自动化学发光成像仪进一步分析。

1.3.3 激光共聚焦分析突变HBsAg抗原性 Huh7细胞转染48h后弃上清，1×PBS清洗后加100μl/孔4%多聚甲醛固定20min，清洗后用0.1% Triton X-100穿孔10min，3% BSA室温封闭2h，之后用HBsAg马多克隆抗体(1:250)和抗-His标签蛋白小鼠单克隆抗体(1:1000)为一抗37℃孵育2h，清洗后加DyLight650标记的山羊抗马二抗(1:500)和Cy3标记的山羊抗小鼠二抗(1:500)37℃避光孵育40min，然后用DAPI染核10min，再次清洗后在Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察分析结果，每个样本捕获至少10张不同视野下的共聚焦图片。抗原性改变的检测是分别用抗-HBs、抗-His检测HBsAg-His标签融合蛋白，计算抗-HBs/抗-His比值，通过比较突变株与野生株的比值来评估。

1.3.4 双抗体夹心法分析突变HBsAg抗原性HepG2细胞转染72h后，胰酶消化收集细胞，离心弃上清，加适量PBS、超声裂解细胞，离心后收集上清于–80℃冻存备用；用包被液(0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)将抗-myc标签蛋白小鼠单克隆抗体稀释至10μg/ml，100μl/孔包被2个96孔ELISA板，4℃过夜；TBST清洗后用5%脱脂牛奶室温封闭2h；清洗后每个ELISA板上样100μl/孔野生型及突变型HBsAg-myc-His融合蛋白，37℃孵育1h；再次清洗后1个板加HRP标记的His标签蛋白小鼠单克隆抗体(1:1000)，另1个板加HBsAg马多克隆抗体(1:200)，37℃孵育1h，第2板再加HRP标记的马二抗(1:5000)37℃孵育30min；加HRP发光底物37℃孵育30min后加终止液终止反应，检测450nm处吸光度(OD)值，分别读取HBsAg马多克隆抗体和抗-His标签蛋白抗体检测的OD值，求各样品HBsAg/His标签检测比值。每个样品3个复孔，独立操作至少3次。

1.3.5 HBsAg临床检测试剂检出突变HBsAg能力的评估 先测定胞内野生型及突变型HBsAg-His标签融合蛋白浓度，具体为采用抗-His标签蛋白单抗检测野生型/突变型融合蛋白表达(Western blotting)，采用Image J软件读取灰度值，求出各样品融合蛋白含量比值(即以His标签蛋白检测值作为融合蛋白表达内参，该过程重复3次求均值)，然后将野生型融合蛋白用德国Roche Elecsys试剂进行绝对定量(IU/ml)，根据比值得出各突变样品HBsAg-His标签融合蛋白浓度。随后将各样品稀释为2.5、0.5、0.1ng/ml 3种浓度梯度(2IU/ml≈1ng/ml)，用Roche公司Elecsys定量及定性试剂，美国ADI和Bio-Rad、北京万泰及上海科华公司的ELISA试剂检测HBsAg，具体过程及结果分析根据说明书操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。定量数据以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析或两因素方差分析，组内多重比较采用Dunnett t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 N-糖基化突变验证 Western blotting结果显示，野生株产生的HBsAg-His标签融合蛋白由2个条带组成，即1条固有s146-148NCT N-糖基化条带和1条27kD非糖基化条带(HBsAg分子量24kD，融合His和myc标签后增加约3kD)，而4种突变融合蛋白均显示3个条带，且每增加一个N-糖基化位点，分子量增加约3kD；用去糖基化酶PNGase F去糖基化处理后，所有融合蛋白只剩余1条27kD的非糖基化条带(图1)。

图1 N-糖基化突变位点的Western blotting分析Fig.1 Confirmation of additional N-linked glycosylation sites (Western blotting)

2.2 N-糖基化突变HBsAg抗原性分析 激光共聚焦结果(图2A、B)显示，与野生株相比，4种N-糖基化突变HBsAg/His标签的荧光强度比值分别降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%(P＜0.00001)。双抗体夹心法得出类似结果(图2C)，4种N-糖基化突变HBsAg/His标签的OD值相对比值较野生株比值分别降低了63.8%、45.1%、45.6%和33.6%(P＜0.00001)。

2.3 HBsAg临床检测试剂检测突变HBsAg 采用6种HBsAg临床检测试剂检测胞内HBsAg-His标签融合蛋白的结果显示，与野生株相比，新型突变株M1、M2和M3产生的突变HBsAg对6种HBsAg检测试剂反应性均明显降低(P＜0.05)，M4产生的HBsAg仅对ADI、万泰和科华的ELISA试剂的反应性降低；M3的突变HBsAg对6种试剂的反应性均降低且最明显，突变蛋白在0.5ng/ml和0.1ng/ml 2个浓度水平不能被ADI、Bio-Rad、万泰及科华4种试剂检测到，在2.5、0.5、0.1ng/ml的3个浓度水平均不能被万泰ELISA试剂检测到(图3)。

图2 4种N-糖基化突变HBsAg抗原性分析Fig.2 Evaluation of HBsAg antigenicity of 4 N-glycosylation mutations

图3 6种HBsAg商业检测试剂与4种突变型及野生型融合蛋白反应性检测Fig.3 Detection profile of four OBI-related mutants and the wild-type against 6 commercial HBsAg detection assays

3 讨 论

N-糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，在蛋白折叠与转运、免疫应答、病毒入侵、病毒感染力及维持蛋白稳定等多种过程中发挥关键作用。HBV S基因MHR区的“a”决定簇由半胱氨酸残基经二硫键形成两个袢环(第1个袢环位于aa124－137，第2个袢环位于aa139－147)，该空间结构是中和抗体抗-HBs作用的靶区域，对维持HBsAg抗原性具有重要意义。第2个袢环结构aa146位置潜藏有一个高度保守的N-糖基化位点，仅在约50%的包膜蛋白中发挥作用，利于病毒包装，并对保护决定簇结构域免受抗-HBs影响有一定作用。目前已报道的N-糖基化位点主要位于aa 113、114、115、116、117、118、123、129、130、131和136，其中最常见的位点是aa115、129、130和131，以aa替换突变形式为主[12,15-17]。

本研究采用去糖基化酶PNGase F处理隐藏N-糖基化突变位点的样品，并对比处理前后的Western blotting结果，以野生株和已知N-糖基化突变sQ129N作为对照，证实了M1－M3为新型N-糖基化突变，其中M2发生位点和突变形式为本课题组首次报道，M1、M3发生位点已被报道，但突变形式为本课题组首次报道。M1、M2分别在aa115－116和aa126－127之间插入aa序列“INGTST”和“RPCMNCTI”，分别形成1个新增的N-糖基化修饰，分子量增加约3kD；M3在aa113－118和aa131－133之间同时发生缺失、替换突变，形成双N-糖基化修饰，分子量增加约6kD。

包膜蛋白每增加1次N-糖基化修饰，其分子量增加约3kD，新增N-糖基化引起HBsAg过度糖基化修饰，可能掩盖B细胞表位，干扰HBsAg与抗-HBs识别，导致免疫逃逸。国内外学者研究发现，N-糖基化突变可促进病毒分泌，减弱与中和抗体反应性，而不影响HBsAg表达[12,16-17]。本课题组前期研究发现[14,18]，用Roche定量试剂检测N-糖基化突变株转染后细胞上清和胞内HBsAg水平，均较野生株水平显著降低。但用抗-His标签抗体检测胞内HBsAg-His标签融合蛋白，其表达量并未降低或轻度降低，说明用HBsAg分泌及表达水平下降并不能很好地解释OBI现象。笔者推测可能主要由于HBsAg经新增N-糖基化修饰后，掩盖了HBsAg抗原表位，干扰抗-HBs结合；另外新增N-糖基化修饰可能引起包膜蛋白错误折叠，导致HBsAg空间构象改变，不能被抗-HBs识别；二者导致突变HBsAg抗原性降低，不能被当前HBsAg临床检测试剂有效检出。

为阐明N-糖基化突变能否降低HBsAg抗原性，本研究采用体外表达HBsAg-His标签融合蛋白，融合蛋白仍具有很好的抗原性，且His标签不涉及抗原性、能够较真实反映HBsAg融合蛋白实际表达水平，故将His标签作为内参、用抗-His标签抗体检测，该研究策略已经在既往研究中得到验证[12,19]。激光共聚焦和双抗体夹心法两种结果显示，N-糖基化突变M1-M4的HBsAg抗原性均较野生株显著降低，支持我们的推测。本课题组进一步用HBsAg临床检测试剂检测野生株及4种突变株，结果显示新型突变株M1、M2、M3对6种检测试剂(包括德国Roche公司HBsAg定量、定性试剂)的反应性均较野生株明显降低，M4对3种试剂的反应性较野生株降低；新型突变株M3对6种试剂反应性降低且最差，突变抗原在0.5ng/ml和0.1ng/ml水平时，4种ELISA试剂均检测失败。业已证实M3新增2个N-糖基化修饰，研究表明随着N-糖基化修饰数量增多，包膜蛋白呈高糖基化状态，突变HBsAg越不容易被抗-HBs结合或识别，进一步证实了本研究推测。

本研究有1例OBI患者(携带突变株M1、M2和M4)发生HBV相关的原发性肝细胞癌(HCC)。既往研究显示前S/S基因突变与肝脏疾病尤其是HCC的进展密切相关[9,20]。本课题组前期研究发现在HBsAg和抗-HBs双阳性患者中MHR区N-糖基化突变是HCC所谓危险因素之一[21]。N-糖基化突变会降低HBsAg抗原性，导致免疫逃逸从而无法被机体有效清除，吏机体长期处于隐匿性感染状态，另外包膜蛋白错误折叠，聚集在内质网，引发内质网应激，DNA氧化损伤，可促进肝脏疾病进展直至发生HCC。因此本例患者携带的3种N-糖基化突变与其他因素共同作用，可能促使其发生HCC。

综上所述，N-糖基化突变与OBI发生密切相关，其抗原性降低为引发OBI的主要原因，3种新型N-糖基化突变株表达的突变HBsAg显著影响了目前临床常用的HBsAg检测试剂的敏感性。本研究结果对OBI发生机制提供了新认识，为改进HBsAg检测试剂提供了一定理论依据。

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