赵丽，李晓东，陈容娟，邵金曼，周怡，思兰兰，许智慧，刘妍，徐东平

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性公共卫生问题，据统计，全球大约有2.4亿慢性HBV感染者，其中我国有9300万左右，每年死于HBV相关疾病的人数多达75万[1-2]。目前核苷(酸)类似物(NAs)是治疗HBV感染的主要药物，主要包括核苷类药物拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)、恩替卡韦(ETV)和核苷酸类药物阿德福韦酯(ADV)、替诺福韦酯(TDF)。ADV是继LAM之后第2个应用于临床抗HBV治疗的NAs药物。与其他NAs类药物作用原理相同，ADV通过抑制HBV反转录酶活性进而抑制HBV复制，但对HBV原始复制模板cccDNA无直接抑制作用，因此需要长期用药[3]。ADV的耐药基因屏障较低，有研究显示ADV初治患者5年耐药发生率为29%[4]。

rtA181T突变的出现与拉米夫定和阿德福韦用药相关，并可引起对ADV敏感性的轻微下降，但半数最大效应浓度(EC50)值升高＜2倍，单独出现不足以引起ADV临床耐药[5-6]。大多数rtA181T突变可引起相应sW172终止突变，产生的截短型HBsAg易于积聚在内质网则产生内质网压力，引起氧化应激反应，增加了肝细胞癌的发生风险[7-9]。但少数rtA181T突变也可引起sW172位点非终止突变，包括sW172S和sW172L两种。目前对非终止突变的临床发生特点和意义及其表型变化的研究十分有限[10]，缺乏基于大样本研究的数据。针对上述问题，本研究分析大样本慢性乙型肝炎患者中rtA181T突变引起S区终止型和非终止型HBsAg的临床发生特点，并比较两者在联合原发ADV耐药突变rtN236T时对HBsAg表达、病毒复制力和ADV耐药性影响的差别，以帮助明确rtA181T/sW172非终止突变发生的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2011年7月－2016年7月于解放军302医院就诊的12 708例乙型肝炎患者血清样本的测序检测结果。排除HIV、HDV等混合感染者；排除原发性肝癌患者；排除酒精性肝病及自身免疫性肝病患者；排除原发性肝癌患者。患者血清样本保存于–20℃，所有常规临床指标均由该院临床检验中心完成。本研究经解放军302医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 主要试剂 血清中病毒DNA提取采用四川天泽公司DNAout试剂提取盒。PCR试剂盒购自北京全式金公司；pGEM-Teasy载体购自美国Promega公司；Xho Ⅰ/Sph Ⅰ内切酶及T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司；pTriEx-HBV 1.1倍载体由法国里昂大学Zoulim教授惠赠；FuGENE HD转染试剂盒购自美国Roche公司；DMEM培养基购自Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 临床和实验室检查 收集每例患者接受NAs治疗前后的临床和实验室数据，包括人口统计资料、NAs治疗史、血清HBV DNA水平和生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆碱酯酶(CHE)等。

1.3.2 HBV RT区基因突变分析及基因型分析 采用病毒DNA提取试剂提取患者血清中的HBV DNA，应用本课题组建立的超灵敏巢式PCR方法扩增HBV RT基因(国家发明专利ZL200910092331.1)[11]。送PCR产物进行双向测序，对rt80、rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt236和rt250等经典和潜在的LAM、ADV、ETV耐药相关位点的序列峰图进行分析。按照文献[12]中的方法进行HBV基因分型。

1.3.3 基因克隆 将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体，然后随机挑选≥20个克隆进行DNA测序并分析耐药相关突变。

1.4 1.1倍pTriEx-HBV重组质粒构建及鉴定 提取rtA181T/sW172S+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172stop+N236T和野生型质粒，经Xho Ⅰ和Sph Ⅰ双酶切后将RT区片段连接至pTriEx–HBV(C)1.1倍载体上，转化至感受态细胞，接种LB培养板(含有100μg/ml氨苄西林)，37℃培养箱过夜，随机挑取样品进行克隆测序，鉴定HBV表达载体构建成功后，制备转染级相关突变株克隆质粒备用。

1.5 定点突变 根据实验需要，将rtA181T/sW172stop+N236T进行定点突变回复为N236T突变株。根据原始序列设计1对正反向引物，引物长度为25～50个碱基。以原突变质粒为模板，PCR扩增，产物经甲基化酶Dpn Ⅰ处理，选择性保留突变成功的质粒。将消化后产物转化到感受态细胞，37℃过夜，挑选2～3个样品测序验证，获得突变成功质粒。具体方法按试剂盒说明书进行。

1.6 构建1.1倍重组载体转染细胞检测复制力及HBsAg水平 转染前1d将HepG2细胞按1×105个/孔置于24孔板中，待细胞生长至60%～80%融合时，每孔加入0.25μg质粒转染到HepG2细胞。转染4h后，分别加入浓度梯度的ADV(0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L)，每2d更换相应药物浓度的新培养液，连续4d后收集细胞上清，采用实时荧光定量PCR检测HBV DNA水平。重复实验3次。病毒的复制力以无药物压力下自然产生的HBV DNA水平评价，病毒的药物敏感性以EC50评价，EC50值越高表明药物敏感性愈低。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析。定量数据以±s或M(Q1，Q3)表示，采用方差分析及两样本独立t检验进行比较。定性资料率及组成比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV rtA181T突变患者的临床特点 在12 708例慢性乙型肝炎患者中，有504例(3.96%)患者检出rtA181T突变，其中男性443例，女性61例，年龄43.0±10.54岁，ALT 47(27～100)U/L，AST 43(27～90)U/L，TBIL 15.20(10.80～25.20)μmol/L，HBV DNA载量4.92±1.86log10IU/ml。根据rtA181T阳性突变患者的性别匹配相应的rtA181T阴性突变患者并对二者进行比较，结果显示rtA181T阳性突变患者年龄、ALT、CHE、HBV DNA水平显著高于rtA181T阴性突变患者，差异有统计学意义(P＜0.05)。rtA181T阳性突变患者基因型分布(C型96.03%，B型3.97%)与rtA181T阴性突变患者(C型81.50%，B型18.50%)比较存在显著差异(P=0.013)。相对于rtA181T阴性突变患者，rtA181T阳性突变患者接受ADV治疗的比例更高(表1)。

2.2 rtA181T突变与其他NAs耐药突变共存情况直接测序结果显示，有504例患者检出rtA181T突变，其中有270例rtA181T突变单独出现，44例伴随恩替卡韦耐药突变，31例伴随拉米夫定耐药突变，13例伴随多重耐药突变(即同时出现核苷类与核苷酸类药物的耐药突变)。此外有146例伴随ADV耐药突变，包括17例rtA181T+A181V、81例rtA181T+N236T，40例rtA181T+A181V+N236T、5例V173L+L180M+A181T+A181V+N236T、2例L180M+A181T+A181V+N236T和1例L180M+A181T+A181V+N236T(表2)。

表1 rtA181T阳性突变与rtA181T阴性突变患者的临床资料分析Tab.1 Clinical features of the patients with and without rtA181T mutation

2.3 rtA181T突变的测序峰图结果 分析504例rtA181T突变病毒测序峰图出现，其对应sW172突变有1种终止突变和2种非终止突变(L、S)，包括409例(81.1%)sW172stop，29例(5.8%)sW172L，15例(3.0%)sW172L和51例(10.1%)sW172终止与非终止突变株共存；突变株可与野生株(wt)共存(图1)。

2.4 ADV耐药患者中rtA181T/sW172stop终止突变与rtA181T/sW172非终止突变的临床特点 表3比较了ADV耐药患者中单独出现的rtA181T/sW172stop突变联合rtN236T突变与rtA181T/sW172L或sW172S联合rtN236T突变患者的临床资料和实验室检测指标，结果显示，两组患者在年龄、性别、ALT、AST、CHE等方面差异无统计学意义，但前一组患者血清HBV DNA水平明显低于后一组(3.63log10IU/ml vs. 5.07log10IU/ml，P=0.013)。

2.5 体外实验突变株HBsAg、HBV DNA水平测定及表型耐药分析 罗氏定量结果显示，转染rtA181T/sW172stop+N236T突变株重组质粒后，HepG2细胞上清中的HBsAg低于检测下限，而rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突变株重组质粒后HBsAg表达水平仅较野生株轻微降低(图2A)。病毒复制力检测显示，rtA181T/sW172stop+N236T突变株复制力水平相对于野生株低于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T突变株(P＜0.05，图2B)。表型耐药分析结果显示，rtA181T/sW172stop+N236T、rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株与对应野生株相比，其对ADV的耐药倍数分别为3.69倍、5.49倍、7.38倍。rtA181T/sW172stop+N236T病毒株对ADV的敏感性高于rtA181T/sW172L+N236T、rtA181T/sW172S+N236T病毒株(表4)。

表2 rtA181T突变与其他NAs耐药突变共存情况Tab.2 The mutants concomitancy of rtA181T mutant and other nucleoside (acid) analogues resistant mutants

图1 rtA181T突变引起S区172编码序列改变的类型Fig.1 Changes of S gene 172 amino acid coding sequence caused by rtA181T mutation

表3 ADV耐药患者中rtA181T/sW172非终止突变与终止突变的临床资料比较Tab.3 Clinical features of ADV resistant patients with rtA181T/sW172stop and non-stop mutations

图2 培养上清中HBsAg定量结果(A)和突变株复制力评价(B)Fig.2 Quantitation of HBsAg in supernatant (A) and assessment of viral replication capacity of mutant strain (B)Dashed line represents lower limit of detection for HBsAg (0.05IU/ml). (1)P＜0.05 compared with wild type

表4 ADV对野生型及4种突变型病毒株的EC50比较Tab.4 Phenotypic resistance of wild type and 4 ADV-resistant mutants

3 讨 论

以往ADV曾经作为临床一线药物被广泛使用，虽然我国2015年的《慢性乙型肝炎防治指南》已将ETV和TDF列为一线临床抗病毒药物[13]，但受经济条件和用药习惯等因素的影响，临床上ADV的应用仍占有相当比例。常见的ADV原发耐药突变有rtN236T和rtA181V[14]，此外还有本课题组前期发现的rtN236V和rtA181S[15-16]。一般认为，当突变株对ADV的EC50达到野生病毒株的2倍以上时可引起耐药[17]。以往有研究显示，rtA181T、rtAN236T、和rtA181V突变株对ADV的EC50值分别为野生株的1.2±0.5倍、7.0±4.1倍和4.3±1.2倍[5]。rt181T虽然不是原发ADV耐药突变，但与ADV用药相关，被认为是一种非典型的ADV耐药相关突变。大多数rtA181T突变可导致sW172终止突变，影响HBsAg的表达和分泌[7]，但以往缺少对rtA181T/sW172非终止突变的认识，最近有研究揭示了rtA181T/sW172终止突变与rtA181T/sW172L突变对病毒复制、HBsAg表达和分泌具有不同影响[18]，但至今尚未见rtA181T/sW172非终止突变发生特点的临床大样本分析及其联合原发ADV耐药突变时耐药性变化的报道。

本研究应用直接测序法分析了12 708例慢性HBV感染者的耐药突变信息，检出的rtA181T突变患者占3.96%。74.6%的rtA181T突变患者有ADV治疗史，表明rtA181T突变与ADV用药相关。146例rtA181T突变与ADV耐药突变共同出现，其中有81例rtA181T与N236T共同出现。本研究结果显示，rtA181T/sW172stop+N236T突变株的复制力显著低于rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突变株；rtA181T/sW172stop+N236T突变株对ADV的耐药性与野生株相比提高了3.69倍，而rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T对ADV的耐药性则分别提高了5.49倍和7.83倍。病毒的耐药性及自然复制力是决定病毒株在药物压力下复制竞争力强弱的两个要素，rtA181T/sW172非终止突变株的ADV耐药性提高应与其自然复制力较高密切相关，但由于rtA181T/sW172非终止突变株需要同时出现两种核苷酸突变，限制了其发生。此外，病毒对机体免疫反应性的适应性也可影响病毒的复制竞争力。rtA181T/sW172终止突变可导致产生截短型HBsAg，引起一个CTL重要表位env335-343(即s172-180)的缺失[19]。HBV从rtA181T/sW172终止突变转变为rtA181T/sW172非终止突变时，虽然病毒的复制力可增加，但可能引起该表位特异性CTL的攻击。总之，rtA181T/sW172非终止突变的发生取决于病毒、药物与机体免疫三方面的综合影响，其具体机制还需要更深入的研究。

本研究证实，在体外实验中rtA181T/sW172终止突变可导致HBsAg分泌表达缺陷，而rtA181T/sW172非终止突变对HBsAg分泌表达的影响较小，但携带两种突变病毒的患者HBsAg水平并无明显差异，分析原因是大多数患者体内rtA181T突变株与野生株共存，即使未检出与野生株共存，由于PCR直接测序法只能检测到20%以上的病毒序列，仍可能与少量野生株共存，提供病毒所需的HBsAg。本研究结果还表明，rtA181T/sW172终止突变联合rtN236T突变株的病毒复制力明显低于两种rtA181T/sW172非终止突变联合rtN236T突变株，这与我们观察到的临床现象相符，即感染rtA181T/sW172stop+N236T突变病毒的患者HBV DNA水平显著高于感染rtA181T/sW172L或sW172S+N236T突变病毒的患者(表2)，提示与rtA181T/stop+N236T突变株相比，rtA181T/sW172L+N236T和rtA181T/sW172S+N236T突变株引起的病毒学反跳水平较高，更应引起临床重视。

总之，本研究通过对大样本的临床患者进行测序，明确了我国慢性HBV感染患者rtA181T/sW172非终止突变的临床发生特点，明确了在联合rtN236T突变时，rtA181T/sW172非终止突变可较非终止突变赋予病毒更高的ADV耐药性，这些发现加深了对HBV耐药突变的认识，可为临床合理监控耐药提供帮助。

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