陈佳玉，张殿宝，李 莹，王丽平，王浩林

(中国医科大学1.第一临床学院；2.基础医学院，辽宁 沈阳110122)

人皮肤角质形成细胞(keratinocytes)是人皮肤表皮层的主要组成部分，在皮肤表皮的稳态维系和创面修复中起关键性作用[1]。目前，自体角质形成细胞的体外培养与移植技术已应用于临床。单独使用角质形成细胞仍然在细胞归巢、移植方式和细胞存活等方面面临挑战，而对细胞进行遗传修饰已成为基因治疗的新途径。常用的转染技术(如病毒法、脂质体法和电穿孔法等)存在安全性和稳定性等问题，迄今也无高效稳定的临床级核酸递送技术[2]。本研究使用PEI-Fe3O4超顺磁纳米颗粒载siRNA向人皮肤角质形成细胞进行递送，为角质形成细胞的siRNA递送寻找新方法，以期应用于临床。

1 材料与方法

1.1 材料:人皮肤角质形成细胞系HaCaT(ATCC)，贴壁增殖，呈铺路石样；PEI-Fe3O4纳米颗粒(东纳生物公司)；DMEM培养液和FBS(Hyclone公司)；siRNA(吉玛基因公司)；Opti-MEM培养基(Gibco公司)；反转录和real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；CCK- 8试剂盒(Dojindo公司)。

1.2 方法

1.2.1 PEI-Fe3O4纳米颗粒的表征：使用透射电镜(120.0 kV)观察纳米颗粒的形态和大小，透射电子显微镜样品制备依文献方法进行[3]。使用动态光散射检测纳米颗粒的流体动力学大小和Zeta电位。

1.2.2 siRNA凝胶阻滞实验：将siRNA NC(negative control，阴性对照) 1 μg按纳米颗粒/siRNA质量比为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.2混合，加opti-MEM培养基至20 μL，室温放置30 min后进行2%琼脂糖凝胶电泳，使用Tanon-1600凝胶成像系统观察并成像。

1.2.3 siRNA转染：将HaCaT细胞培养于含10% FBS的DMEM培养液，按1×105细胞/孔接种6孔板并培养过夜。将纳米颗粒与GAPDH siRNA按4 μg/1 μg、8 μg/1 μg、8 μg/2 μg和8 μg/4 μg的比例混合，室温孵育15 min后加入细胞，过夜培养后换液。……