郑晨辉 徐小宏 孙秋华 王蓓⋆

外科术后肠动力障碍（Postoperative Ileus，POI）被认为外科术后“不可避免的”临床并发症，常表现为腹痛腹胀、肛门停止排气排便等肠梗阻症状，严重者可出现负氮平衡、体重下降、肠道黏膜萎缩、肠道菌群失调和移位等严重并发症［1］。本课题组前期研究表明参黄散外敷POI大鼠的脾俞和肾俞，可通过减轻小肠平滑肌的炎症反应，促进胃肠道传输，同时还可促进胃肠道激素Ghrelin的分泌和小肠平滑肌Ghrelin受体的表达［2］。外科术后胃肠道激素对肠道功能的恢复和机体氮平衡发挥重要作用。本文探讨参黄散外敷POI大鼠对血清胃肠道激素的影响，以期为参黄散临床推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SD雄性大鼠24只，3个月龄，体质量252～302g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号为SCXK（沪）2013-0016。动物饲养于浙江中医药大学屏障级动物实验中心，动物饲养环境：室温21～23℃，湿度40%～60%，每12h更替光照，24h供应无菌饲料及饮用水。

1.2 试剂和仪器 Motilin（Porcine）RIA Kit（RK-045-03）；Calcitonin Gene Related Peptide（CGRP）Rat RIA Kit（RK-015-09）；Obestatin Rat Ultra sensitive RIA Kit（RKU-031-90）；Vasoactive Intestinal Peptide（VIP）Rat RIA kit（RK-064-16），试剂盒均购于美国Phoenix Pharmaceuticals公司；GPR39抗体（ab213716，abcam公司）；Obestatin抗体（GTX79314，GeneTex公司）；SDS-PAGE电泳系统（BIO-RAD公司）；高速匀浆机（GLAS-COL德国）。

1.3 药物 参黄散由人参300g、丹参300g、大黄300g、枳实200g、厚朴200g、丁香100g、吴茱萸100g等药组成，每包3g生药。透皮剂由厚朴、 吴茱萸和丁香经90%乙醇加热回流提取所得，采用微量胡椒粉辅助，均由浙江省中医院制剂室制作提供。

1.4 方法 （1）动物模型制备和给药：参照文献［3］制备改良型SD大鼠POI模型。大鼠术前24h禁食，异氟烷吸入麻醉，在无菌操作下，取腹部正中切口切开腹腔，将小肠及盲肠向左侧翻出腹腔，置于生理盐水浸湿的纱布上，用两棉棒自胃十二指肠向回盲部和部分结肠探查2次约10min，使少量肠内容物过回盲部，致胃肠道壁充血水肿明显，盐水纱布覆盖小肠10min后将小肠按顺序还纳，关闭腹腔。取24只SD大鼠分为假手术组（SHAM）、模型组（IM）和参黄散组（SHP），每组各8只。假手术组仅行开腹操作；参黄散组造模后取参黄散药包，滴数滴透皮剂至药包，均匀浸透后帖敷于大鼠脾俞和肾俞，模型组造模后使用等量透皮剂滴入细沙包外敷，各组每隔3h换1次药包或细沙包。（2）单位体重增加百分数、标准化摄入量和结肠传输时间测定：大鼠称体重和摄入量均在术后24h、48h和72h时间点。动物禁食前所称体重作为初始体重。单位体重增加百分数=（观察点体重-初始体重）/初始体重×100%；大鼠标准化摄入量=观察点累积摄入量/每100g观察点体重（g/100g b.wt.）。参考文献［4］测定结肠传输时间，将直径2mm玻璃球经SD大鼠肛门逆行插入3cm深，然后测定玻璃球从肛门排泄时间作为结肠传输时间。（3）放射免疫法测定血浆胃肠激素浓度：术后第3天，各组SD大鼠安乐处死后即刻从腹腔静脉采血2ml，注入含100g/L EDTA-Na2 20μl和抑肽酶40μl的离心管，颠倒混匀后4℃3000r/min离心15min，上清液移入EP管中，-20℃保存待测。按放免试剂盒说明书测出样品中血清胃动素（Motilin，MTL）、血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）、肥胖抑制素（Obestatin）和降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）含量（pg/ml）。MTL、VIP和 CGRP可测浓度范围均为10～1280pg/ml；Obestatin 可测浓度范围为 5～640pg/ml。（4）Western blot检测和分析：SD大鼠处死后，即刻进腹，游离大小网膜，切取3cm×3cm胃体，4℃ PBS液清洗干净后显微镜下剥离出胃平滑肌层，冰浴中剪碎组织，RIPA裂解匀浆并超声破碎，4℃ 13500r/min，离心20min，取上清液，Bradford法定量测蛋白浓度，制定标准蛋白曲线，8%SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，然后转印至PVDF膜，转膜条件为65V×2h，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，加Obestatin多克隆抗体（1：1000）和GPR39抗体（1：1000）孵育4℃过夜，含吐温PBST液洗脱（10min×2次），加AP标记的二抗（鼠抗兔 1：1000）孵育1h，PBST洗脱二抗（10min×3次），滴加显影液（NBT／BCTP），发光后压片。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参黄散对POI大鼠摄食、体重及结肠传输功能的影响 造模后第3天，与假手术组比较，模型组大鼠标准化摄入量、单位体重增加百分数下降和结肠传输功能时间延长差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参黄散组大鼠标准化摄入量、单位体重百分数增加和结肠传输功能时间下降，差异有统计学意义（P＜0.01）见表1。

表1 各组大鼠单位体重增加百分数、标准化摄入量和结肠传输功能比较（x±s）

2.2 参黄散对POI大鼠血清Obestatin、MTL、VIP和CGRP水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清MTL、VIP和CGRP含量降低差异均有统计学意义（P＜0.01），血浆Obestatin水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参黄散组大鼠血浆VIP含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；MTL和CGRP升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；而血浆obestatin水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）见表2。

表2 各组大鼠血清胃肠激素浓度比较（x±s）

2.3 各组大鼠胃体Obestatin和GPR39的表达 Western blot显示造模术后第3天胃平滑肌层Obestatin及其受体GPR39表达在各组均有阳性条带。与假手术组比较，模型 组Obestatin和GPR39表达均增加差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，参黄散组Obestatin和GPR39表达减少，差异有显著统计学意义（P＜0.01）见图1。

图1 各组大鼠术后第3天胃平滑肌Obestatin和GPR39的表达

3 讨论

POI是常见医源性腹部甚至非腹部手术并发症。研究表明常规腹部手术胃肠道各段的蠕动恢复时间并不相同，小肠蠕动恢复平均约24h，胃为24～48h，而结肠为48～72h。有学者提出早期POI是正常生理现象，术后POI＞3d甚至＞6d才考虑病理性肠动力障碍。Ryash Vather等［5］复习文献提出延迟性外科术后肠道功能障碍（Delayed Postoperative Ileus，DPOI）和复发性外科术后胃肠功能障碍（Recurrence Postoperative Ileus，RPOI）的概念和诊断标准，具有一定的临床意义。鉴于此，本实验选择术后3d为观察时间点，并以结肠传输时间反映胃肠道传输功能更为客观合理。然而，基于传统POI发病的核心环节是手术促发小肠平滑肌层炎症反应，单纯作用某一靶点减轻肠道炎症级联反应或免疫反应，临床研究表明治疗效果并不理想［6］。表明POI时胃肠功能障碍的病理生理极其复杂，考虑是多因素或系统协同作用结果，如术后胃肠道激素的变化、围手术期麻醉药、镇痛药和抗胆碱药、水电解质紊乱和手术创伤等。在诸多与POI相关的胃肠激素中，Obestatin是与Ghrelin同一基因编码的由23个氨基酸组成的酰胺化脑肠肽，是G蛋白偶联受体GPR39的内源性配体，在大鼠胃和小肠均有表达，通过Obestatin/GPR39系统发挥其生物学活性，具有持续性抑制胃排空速度和抑制肠道收缩等效应，同时抑制摄食和降低体质量。注射外源性Obestatin 后可以明显抑制大鼠的摄食量和体质量的增加，且呈时间和剂量依赖性关系［7］。CGRP是一种含有37个氨基酸的神经肽，由胃肠道的壁内神经元合成，具有调节胃肠血流和运动功能，减轻胃肠道的炎症反应，同时抑制肠道T细胞的增殖，降低巨噬细胞的抗原提呈活性及活化淋巴细胞的功能［8］。VIP是由28个氨基酸组成的直链阳离子神经肽，可增加胃肠道蠕动和促进消化，同时抑制肠道TNF、IL-6 和IL-12 的产生及iNOS 的诱导，刺激抗炎细胞因子IL-10 的产生［6，8］。MLT属兴奋性胃肠激素，是由22个氨基酸组成的多肽，主要存在于十二指肠及近端空肠黏膜内分泌细胞中，胃动素主要调控消化间期肌电复合波（interdigestive myoelectric complex，IMC）周期性活动，明显促进胃运动和胃电活动，且作用持久［9］。

中医中药治疗POI具有一定优势，本课题组根据辨证施治，由7味中药组成的参黄散外敷POI大鼠可减轻小肠平滑肌炎症反应，促进胃肠道传输，同时还可促进Ghrelin的分泌和小肠平滑肌Ghrelin特异性受体GHSR-1α的表达。当Ghrelin与其受体GHSR-1α结合后可激活多个信号通路，对机体能量代谢起正性调节作用，促进胃肠道传输和胃酸分泌。本研究表明POI时除Ghrelin外还影响其它胃肠道激素的分泌，血清促胃肠动力激素CGRP、MLT和VIP浓度下降，而抑制胃肠道蠕动的血清Obestatin浓度增加，胃体Obestatin和GPR39表达也明显增加，结肠传输时间延长。参黄散外敷POI大鼠可促进CGRP、MLT、VIP 的分泌并抑制Obestatin的产生及其受体表达，单位单位体重增加百分数和标准化摄入量均增加，显示正氮平衡。课题组前期表明参黄散促进胃肠蠕动的核心成分是橘皮苷（Hesperidin）、槲皮素（Quercetin）、芦荟大黄素（Aloeemodin）、厚朴酚（Magnonol）、大黄（Chrysophanol）、人参皂苷 Rgl，Rbl（Ginsenosides Rgl，Rb1）［10］，具体如何调节胃肠激素变化有待进一步研究。总之，参黄散外敷POI大鼠特别是延迟性POI可经多靶点发挥作用，体现中医中药治疗本症的优势。

［1］ Smart CJ,Malik KI.Prucalopride for the treatment of ileus.Expert Opin Investig Drugs,2017,26(4):489-493.

［2］ 徐小宏,陈友雷,魏星,等.参黄散对术后肠动力障碍大鼠胃肠功能、血清Ghrelin水平及其小肠平滑肌受体表达的影响. 科技通,2015,31(11):105-109.

［3］ 徐小宏,陈友雷,魏星,等.参黄散对术后肠动力障碍大鼠胃肠功能及小肠ICAM-1、IL-10、IL-1β和iNOS表达的影响. 浙江中医药大学学报, 2015,39(11):777-781.

［4］ Engel DR, Koscielny A, Wehner S, et al. T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.Nature Medicine, 2010, 16(12):1407-1413.

［5］ Vather R, Trivedi S, Bissett I. Defining postoperative ileus: results of a systematic review and global survey. Journal of gastrointestinal surgery, 2013, 17(5): 962-972.

［6］ Van Bree SH, Nemethova A, Cailotto C, et al. New therapeutic strategies for postoperative ileus. Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2012(9): 675-683.

［7］ Luque RM, Córdoba-Chacón J, Ibáñez-Costa A, et al.Obestatin plays an opposite role in the regulation of pituitary somatotrope and corticotrope function in female primates and male/female mice. Endocrinology, 2014, 155(4): 1407-1417.

［8］ Berdún S, Rychter J, Vergara P. Surgical intestinal manipulation increases gene expression of TrkA, CGRP, and PAR-2 IN dorsal root ganglia in the rat. Neurogastroenterol Motil,2016,28(6):816-826.

［9］ Goetz B, Benhaqi P, Glatzle J,et al. Changes in peptidergic neurotransmission during postoperative ileus in rat circular jejunal muscle.Neurogastroenterol Motil,2014,26, 397-409.

［10］ Askar B, Ibrahim H, Barrow P, et al. Vasoactive intestinal peptide(VIP) differentially affects inflammatory immune responses in human monocytes infected with viable Salmonella or stimulated with LPS.Peptides,2015,71:188-195.