胡敏

【摘要】 目的：研究HBV感染后慢性肝炎患者中纤维凝胶蛋白2（Ficolin-2）的表达及其与肝脏炎症进展之间的关系。方法：研究对象为101例HBV感染后慢性肝炎患者和120例健康对照者，采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血浆Ficolin-2水平，全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）检测HBV DNA含量。结果：慢性肝炎患者血浆Ficolin-2水平明显高于健康对照组[（24.19±11.05）μg/ml vs （11.77±5.55）μg/ml]，差异有统计学意义（P<0.01），ALT水平也明显高于健康对照组[（156.22±72.55）IU/L vs （20.58±8.87）IU/L]，差异有统计学意义（P<0.01），线性回归分析表明血浆Ficolin-2水平与ALT水平呈正相关（R=0.813，R2=0.661，P<0.01），而与HBV DNA含量未见明显相关性（R=0.105，R2=0.011，P=0.296）。结论：HBV感染后慢性肝炎患者血浆中Ficolin-2的表达与肝脏炎症程度密切相关，可以作为一个有效的辅助指标来评价肝脏炎症程度。

【关键词】 纤维凝胶蛋白2； 乙型肝炎病毒； 慢性肝炎； 丙氨酸转氨酶； HBV DNA

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.8.002 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2018）08-0003-04

The Correclation between Ficolin-2 and Hepatic inflammation in Chronic Hepatitis Patients with HBV Infection/HU Min.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（8）：3-6

【Abstract】 Objective：To investigate the possible relationships between expressions of Ficolin-2 and the progression of chronic HBV infection.Method：Ficolin-2 concentrations were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） in the plasma of 101 chronic hepatitis patients with HBV infection and 120 healthy controls.Alanine aminotransferase（ALT） levels were detected using an automatic biochemical analyser.HBV DNA concentrations were measured using commercial realtime RT-PCR kits on an Applied Biosystems Prism 7500 seuqence detector.Result：Plasma levels of Ficolin-2 was （24.19±11.05） μg/ml in chronic hepatitis patients with HBV infection，it was higher than（11.77±5.55）μg/ml in healthy controls（P<0.01），and the result of ALT was （156.22±72.55）IU/L in chronic hepatitis patients with HBV infection，it was higher than （20.58±8.87）IU/L in healthy controls（P<0.01）.Ficolin-2 levels were positively related to the concentrations of ALT（R=0.813，R2=0.661，P<0.01），and had no relattions with HBV DNA（R=0.105，R2=0.011，P=0.296）.Conclusion：High expressions of Ficolin-2 is associated with hepatic inflammation in chronic hepatitis patients with HBV infection，and can be considered as an additional useful marker of liver inflammatory degree.

【Key words】 Ficolin-2； Hepatitis B virus； Chronic hepatitis； Alanine aminotransferase； HBV DNA

First-authors address：Tongcheng Peoples Hospital，Tongcheng 437400，China

機体的天然免疫可以中和病毒感染、触发炎症、促进吞噬细胞吞噬病原体并调节适应性免疫应答，在病毒感染后的识别及病原体的清除过程中有重要作用[1]。天然免疫系统有多种不同的识别和效应机制，其中就包括补体系统[2]。补体是先天体液免疫的关键因子，某些补体成分，如C型凝集素、纤维胶凝蛋白（Ficolin）等在病毒感染细胞、被包围病毒粒子的溶解及病毒的清除过程中发挥着重要作用[3]。Ficolin属于重要的人血清补体凝集素，目前人体内已发现的Ficolin有3种，分别是Ficolin-1（M-Ficolin）、Ficolin-2（L-Ficolin，又称Ficolin/P35）和Ficolin-3（H-Ficolin），其结构与甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin，MBL）类似[4-5]。近年的来研究表明，Ficolin作为一种可溶性的糖类识别蛋白，可以与乙酰葡萄糖、LPS及某些病原微生物（包括细菌、真菌和病毒）等结合激活补体凝聚素途径[6-7]。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重危害人类健康的重要传染病之一，HBV病毒与机体免疫系统间感染和抗感染的关系是疾病发生发展的重要机制。本研究旨在探讨慢性乙型肝炎患者中血浆Ficolin-2的表达与肝脏炎症间的关系，并探讨其可否作为一个有效的辅助指标来评价肝脏的炎症程度。

1 资料与方法

1.1 一般资料

全部病例来自2016年1-6月通城县人民医院门诊或住院的慢性乙型肝炎患者，实验室检测HBV DNA>103 IU/ml，共101例，所有入选病例符合文献[8]2015年中华医学会肝病与感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准，排除其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、脂肪肝及药物性肝病等因素干扰，排除混合（重叠）感染的情况。所有病例均排除心、脑、肾、肺等器官疾病及高血压、糖尿病等疾病。其中男60例，女41例；年龄17～65岁，平均（39±14）岁。健康对照者120例，为病例收集期间的健康体检者，其中男66例，女54例；年龄16～66岁，平均（40±15）岁，排除肝脏、心脑血管、内分泌和肾脏疾病者。

1.2 仪器和试剂

Ficolin-2 ELISA检测试剂盒（Hycult生物技术公司）；ALT检测试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）；HBV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，中山大学达安基因有限公司）；Thermo Multiskan MK3 全自动酶标仪（芬兰Thermo公司）；7600-020型全自动生化分析仪（日立公司）；Prism 7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 血浆Ficolin-2水平检测 采用ELISA法检测血浆Ficolin-2的水平，严格按试剂盒说明操作：将标准品及待测血浆50 μl/孔加入包被有Ficolin-2抗体的96孔板，37 ℃温育1 h；PBS洗涤3次，加入酶标抗体100 μl/孔，37 ℃温育0.5 h；

PBS洗涤3次，加入TMB 100 μl/孔，于室温下显色15 min，再每孔加入1滴终止液终止反应。在MK3酶标仪进行检测，通过标准曲线计算出标本Ficolin-2含量。

1.3.2 血浆ALT水平检测 采用全自动生化分析仪（速率法）检测血浆ALT水平严格按照说明书操作。

1.3.3 血浆HBV DNA水平检测 血浆HBV DNA的提取、扩增、检测及结果分析严格按照达安公司试剂盒说明书（试剂检测限500 IU/ml）操作，采用Prism 7500荧光定量PCR仪进行HBV DNA水平检测。

1.4 统计学处理

統计分析均采用SPSS 17.0统计软件，计量资料用以（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验，两者间线性关系分析采用线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆Ficolin-2、ALT水平和HBV DNA含量

健康对照组、慢性肝炎患者血浆Ficolin-2、ALT水平和HBV DNA含量如表1所示：慢性肝炎组Ficolin-2、ALT水平明显高于健康对照组（P<0.01）；对其HBV DNA含量取对数，慢性肝炎组均值为5.12±1.35，而健康对照组低于试剂检测限，慢性肝炎组明显高于健康对照组。

2.2 慢性肝炎患者血浆Ficolin-2水平与ALT水平的关系

如图1所示，线性回归分析发现，101例慢性肝炎患者血浆中Ficolin-2水平与ALT呈正相关（R=0.813，R2=0.661，F=193.244，P<0.01）。

2.3 慢性HBV患者血浆Ficolin-2水平与HBV DNA含量的关系

如图2所示，线性回归分析表明，101例慢性肝炎患者血浆中Ficolin-2水平与HBV DNA含量无明显相关性（R=0.105，R2=0.011，F=1.103，P=0.296）。

3 讨论

Ficolin本质是一组糖蛋白，主要由肝脏产生，在体内广泛分布。它的编码基因位于第9号染色体长臂上，含有8个外显子。血浆中Ficolin-2是由三链亚单位组成的有序的寡聚体，每条肽链的相对分子量为35 kDa，其结构是由含13个氨基酸的N末端、带有Gly-Xaa-Yaa三聚体重复序列的胶原样区、9个氨基酸组成的颈区和长达209个氨基酸的C末端等4个功能区组成[9-10]。据报道，Ficolin-2在三种亚型中最先被克隆的，其结构类似于MBL、C1q和肺表面活性蛋白（lung surfactant proteins）A和D（SP-A 和 SP-D），在机体抗感染过程早期中发挥着重要作用[4]。

在感染病原体早期，机体内的吞噬细胞会分泌一系列细胞因子，这些细胞因子的释放会刺激肝细胞合成分泌多种急性期反应蛋白，其中就包括了能够激活补体的有MBL以及C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）等。当MBL与病原体表面的甘露糖残基识别后，与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBL-associated serine protease，MASP）结合，使本来没有活性的MASP发生结构改变，从而成为活化的MASP。MASP包括MASP-1、MASP-2和MASP-3三种亚型，均能与MBL结合。研究表明，活化的MASP是具有水解补体活性的酶，可以水解补体C4和C2，随后的反应过程就与经典补体激活途径相同，此种补体活化的途径即为MBL途径或凝集素途径[9]。也有研究表明，Ficolin也能通过此途径发挥作用[11-12]。Ficolin-2或Ficolin-3识别其各自相应的配体并与之结合可以激活MASP-1，成为活化的MASP，后者裂解MASP-2使之激活水解C4和C2，从而产生凝集素途径的C3转化酶C4b2b[11-12]。此外，也有报道Ficolin也可以通过调理吞噬作用参与机体的抗感染过程[13-14]。

目前，有关Ficolin与病毒感染性疾病间的研究不多。Keirstead等[15]报道Ficolin分子在体外可降低猪繁殖及其与呼吸综合征病毒（PRRSV）的感染性。Hu等[16]也曾报道，HCV感染者中血浆Ficolin-2水平与肝脏炎症严重性以及抗病毒疗效密切相关。Pan等[17]研究表明，注射了pcD-NA3.1-L-ficolin真核质粒的小鼠体内的Ficolin-2可能与病毒表面糖蛋白HA、NA相互作用，因而小鼠对流感病毒感染表现出较强的抵抗力。本研究表明，慢性HBV肝炎患者血浆Ficolin-2水平明显增加，提示HBV感染机体后可能长期刺激肝细胞Ficolin-2的表达，使其含量升高，从而成为机体对抗HBV感染的一种天然免疫分子。此外，慢性肝炎的病理改变主要是免疫损伤，炎性因子的作用可能影响疾病的进展。当肝细胞千分之一有炎症时，血清ALT含量就会增高一倍以上，血浆ALT是肝脏炎症程度的重要指标。本研究进一步研究发现，血浆中Ficolin-2与ALT水平呈正相关，与HBV DNA含量未见明显相关性，表明慢性肝炎时血浆Ficolin-2的表达与肝脏炎症程度密切相关，但与病毒本身的活跃程度无关。

慢性HBV感染的病理機制非常复杂，涉及遗传、免疫和环境因素等多种因素。本研究表明，慢性肝炎患者血浆中Ficolin-2的表达与肝脏炎症程度呈高度正相关，因而其可能作为一个有效的辅助指标来评价肝脏的炎症程度。

参考文献

[1] Iwasaki A，Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].Science，2010，327（5963）：291-295.

[2] Dunkelberger J R，Song W C.Complement and its role in innate and adaptive immune response[J].Cell Res，2010，20（1）：34-50.

[3] Leikina E，Delanoe-Ayari H，Melikov K，et al.Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins[J].Nat Immunol，2005，6（10）：995-1001.

[4] Matsushita M，Endo Y，Taira S，et al.A novel human serum lectin with collagen-and fibrinogen-like domains that functions as an opsonin[J].J Biol Chem，1996，271（5）：2448-2454.

[5] Zhang X L，Ali M A.Ficolins：structure， function and associated diseases[J].Adv Exp Med Biol，2008，632：105-115.

[6] Endo Y，Sato Y，Matsushita M，et al.Cloning and characterization of the human lectin P35 gene and its related gene[J].Genomics，1996，36（3）：515-521.

[7] Holmskov U，Thiel S，Jensenius J C.Collections and ficolins：lectins of the innate immune defence[J].Annu Rev Immunol，2003，21：547-578.

[8]中华医学会肝病学分会，感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志，2015，12（23）：889-905.

[9] Runza V L，Schwaeble W，Mannel D N.Ficolins：novel pattern recognition molecules of the innate immune response[J].Immunobiology，2008，213（3-4）：297-306.

[10] Krarup A，Mitchell D A，Sim R B.Recognition of acetylated oligo-saccharides by human L-ficolin[J].Immunol Lett，2008，118（2）：152-156.

[11] Matsushita M，Fujita T.Ficolins and the lectin com plem ent pathway[J].Immunol Rev，2001，180：78-85.

[12] Ohashi T，E rickson H P.The disulfide bonding pattern in ficolin mul-timers[J].J Biol Chem，2004，279（8）：6534-6539.

[13] Lu J，The C，K ishore U，et al.Collectins and ficolins：sugar pattern recognition m olecules of the m am m alian innate immunesystem[J].Biochin Biophys Acta，2002，1572（2/3）：387-400.

[14] Taira S，Kodama N，Matsushita M，et al.Opsonic function and con-centration of hum an serum ficolin/P35[J].Fukushima J Med Sci，2000，46（1/2）：13-23.

[15] Keirstead N D，Lee C，Yoo D，et al.Porcineplasma ficolinbinds and reduces infectivity of porcine reproduc-tive andrespiratory syndrome virus（PRRSV） in vitro[J].Antiviral Res，2008，77（1）：28-38.

[16] Hu Y L，Luo F L，Fu J L，et al.Early Increased Ficolin-2 Concentrations are Associated with Severity of Liver Inflammation and Efficacy of anti-Viral Therapy in Chronic Hepatitis C Patients[J].Scand J Immunol，2013，77（2）：144-150.

[17] Pan Q，Chen H D，Wang F，et al.L-ficolin binds to glycoproteins HA and NA and inhibits influenza A virus infection both in vitro and in vivo[J].J Innate Immun，2012，4（3）：312-324.

（收稿日期：2017-09-27）