陈章祥，吴 波，朱 敏，李 莉，王取南，朱德发

甲状腺功能减退症(简称甲减)可引起中枢神经系统结构和功能异常[1]，甲减患者常存在工作记忆、学习能力损伤[2]，过去研究多基于海马和额叶。甲减的功能影像学显示扣带回等边缘系统在学习、记忆功能中有重要作用[1]。后扣带回(posterior cingulate cortex，PCC)是边缘系统的重要组成部分，是监控感觉及记忆的组织。有研究[3]显示轻度认知障碍的阿尔兹海默症患者即可出现后扣带回损伤，本研究通过神经元的尼氏体和可溶性NSF附着蛋白受体(soluble nethylmaleimidesensitive fusion protein attachment protein receptors,SNARE)复合体中的SNAP-25表达来观察后扣带回改变。尼氏体是神经元的特征性结构之一，主要合成细胞器更新所需蛋白、合成递质所需的酶等。突触相关蛋白25(synaptosomal associated protein25,SNAP-25)是SNARE复合体的重要组成部分，通过影响突触小泡的胞吐外排和递质释放改变突触信号强度[4]，在学习记忆中有重要意义。多奈哌齐(donepezil)是选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，能够提高脑部乙酰胆碱功能，有效改善认知功能障碍，也有研究[5]显示其对神经元有直接保护作用。该研究旨在观察甲减大鼠 PCC内SNAP-25蛋白和尼氏体的表达情况，观察L-T4联合多奈哌齐治疗效果。

1 材料与方法

1.1实验动物清洁级健康SD雄性大鼠(10周龄)40只，240～270 g，购自安徽医科大学实验动物中心。温度21～23 ℃，湿度(55±5)%，自由饮水，标准饲料喂养。实验过程遵循《安徽医科大学实验用动物管理和使用指南》。

1.2主要试剂及仪器

1.2.1试剂 丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(上海朝晖药业有限公司)；左甲状腺钠(levothyroxine，L-T4)(德国默克雅柏药业有限公司)；盐酸多奈哌齐(donepezil)(日本卫材药业有限公司)；三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)、促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)；尼氏染色液(上海碧云天生物技术研究所)；兔来源抗SNAP-25抗体、抗GAPDH单克隆抗体(美国Abcam公司)；DAB染色试剂盒、 辣根过氧化物酶(HPR)标记山羊抗兔IgG抗体(美国Abclonal公司)。

1.2.2仪器 Microfuge 20R台式微量离心机(美国贝克曼库尔商贸有限公司)；Synergy4多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯宝业有限公司)；WD-9405B型脱色摇床(济南科赛特科技有限公司)；DP71光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；Fine-do X6化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.3动物模型制备适应性喂养1周后，采用随机数表法将大鼠随机均分为5组： 正常对照组(CON组)、甲减组(Hypo组)、L-T4替代治疗组(L-T4组)、多奈哌齐治疗组(DON组)、联合治疗组(L-T4+DON组)每组8只。CON组正常饮水，其余4组给予0.05%PTU喂养6周制备甲减模型。造模第5周起，DON组于饮水中加入0.005%多奈哌齐，L-T4组每日给予腹腔注射L-T4(溶于生理盐水，6 μg/100 g体质量)，L-T4+DON组饮用水加入0.005%多奈哌齐以及腹腔注射L-T4。余下3组每日腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠每周称重，治疗共2周，期间根据体质量调整给药剂量。

1.4标本制备10%水合氯醛(0.3 ml/100 g体质量)腹腔注射麻醉大鼠后，打开腹腔，腹主动脉采血。取血后立即断头处死大鼠，于冰台迅速分离大脑后扣带回组织，左侧后扣带回置于-80 ℃冰箱储存，用于Western blot检测；右侧后扣带回浸泡于4%多聚甲醛溶液，固定待做尼氏染色、免疫组化染色。

1.5血清甲状腺激素水平测定放射免疫法测定大鼠血清T3、T4、TSH水平，严格按照放射免疫试剂盒操作说明进行。

1.6尼氏染色大鼠后扣带回蜡片置于60 ℃烤箱30 min，二甲苯脱蜡3次，每次8 min，梯度乙醇水化；三蒸水洗涤3次，每次2 min；尼氏染色液染色1 h(37 ℃)，三蒸水冲去染液；95%乙醇分化3 s，常规脱水、透明、封片；光学显微镜拍摄；图像分析软件分析染色物光密度值，取平均光密度(average optical density,AOD)值。

1.7免疫组织化学染色大鼠后扣带回蜡片置于60 ℃烤箱30 min，二甲苯脱蜡3次，每次10 min，梯度乙醇水化；TritonX-100细胞通透，30%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；柠檬酸盐微波炉加热暴露抗原决定簇；山羊血清封闭；以上各步骤间使用PBS洗涤3次，每次3 min。SNAP-25抗体(1 ∶200)室温孵育1 h后孵育过夜(4 ℃)；HRP标记山羊抗兔IgG孵育30 min(37 ℃)；以上各步骤间使用PBS洗涤5次，每次5 min；DAB显色，常规脱水、透明、封片；应用光学显微镜拍摄；图像分析软件分析免疫反应产物的光密度值，取AOD值。

1.8Westernblot法检测SNAP-25

1.8.1总蛋白提取 取后扣带回组织置于玻璃匀浆器中，加入RIPA裂解液500 μl和蛋白酶抑制剂5 μl，冰上匀浆70～75次。4 ℃、15 000 r/min离心15 min，吸取上清液后4 ℃、15 000 r/min离心5 min，吸取上清液，用Lorry法测定总蛋白浓度。使用2×上样缓冲液稀释定量，100 ℃、10 min蛋白变性，分装保存。

1.8.2Western blot法检测 制备SDS-PAGE凝胶，各组分别取蛋白样本20 μg进行电泳；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转膜3 h；5%脱脂奶粉封闭1 h 30 min，三蒸水洗涤3次，每次7 min；加入一抗SNAP-25(1 ∶5 000)或GAPDH(1 ∶10 000)孵育过夜(4 ℃)。PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗涤10 min；加入HPR室温孵育1 h 30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗涤10 min；滴加ECL发光液，使用化学发光成像仪拍摄蛋白条带； Image pro plus图像分析软件进行光密度分析，计算目的蛋白与内参对照GAPDH的光密度比值。

2 结果

2.1大鼠血清甲状腺激素水平Hypo组、DON组T3、T4浓度较CON组显著降低，TSH水平较CON组显著升高(P<0.01)；L-T4组和L-T4+DON组T3、T4和TSH恢复正常，与CON组比较差异无统计学意义。见表1。

2.2尼氏染色对各组大鼠后扣带回尼氏染色切片进行光密度值分析，Hypo组较CON组AOD值减少 (P<0.05)，神经元内尼氏体数量减少；DON组较Hypo组AOD值增加(P<0.05)，未恢复至CON组水平(P<0.05)；L-T4组较Hypo组AOD值增加(P<0.05)，未恢复至CON组水平(P<0.05)；L-T4+DON组与CON组比较差异无统计学意义，尼氏体数量恢复。见图1、表2。

表1 各组大鼠血清甲状腺素水平

图1 各组后扣带回尼氏染色图片 SP×400

项目CON组Hypo组DON组L-T4组L-T4+DON组F值尼氏染色0.0554±0.00810.0326±0.0033*0.0414±0.0041*#0.0385±0.0042*#0.0547±0.007628.24免疫组化染色0.153±0.0140.223±0.026*0.213±0.029*0.187±0.027*#0.159±0.01916.90

与CON组比较：*P<0.05；与Hypo组比较：#P<0.05

图2 各组后扣带回SNAP-25免疫组化染色图片 SP×200

2.3免疫组化结果光镜下可见后扣带回内SNAP-25免疫复合物呈棕黄色颗粒，Hypo组SNAP-25的AOD值高于CON组(P<0.05)；DON组SNAP-25的AOD值较Hypo组差异无统计学意义，L-T4组SNAP-25的AOD值较Hypo组有下降(P<0.05)，未恢复至CON组水平(P<0.05)；L-T4+DON组SNAP-25的AOD值与CON组比较差异无统计学意义。见图2、表2。

2.4Westernblot结果Hypo组大鼠PCC内SNAP-25表达较CON组显著增加(P<0.05)，L-T4组，DON组损伤蛋白未恢复至正常水平(P<0.05)，L-T4+DON组SNAP-25表达恢复，与CON组比较差异无统计学意义。见图3。

图3 各组大鼠后扣带回SNAP-25的表达

3 讨论

尼氏体是神经元的特征性结构，主要分布于神经元胞体和树突内。当神经元受损，尼氏体将逐渐崩解，甚至消失，这种变化具有可逆性。本研究显示Hypo组大鼠尼氏体相较CON组数量减少，这种减少在甲减大鼠的海马中也有发现[6]，这提示神经元递质合成受到影响。SNAP-25是SNARE复合体组成部分，其在突触膜融合过程中起重要作用，也可以影响SNARE复合体形成过程，进而影响递质释放。免疫组化法和Western blot法显示在Hypo组大鼠PCC内SNAP-25表达较CON组增高。既往有研究[7]显示甲减大鼠海马内SNAP-25表达增高，在成年期甲减大鼠额叶也表达增高[8]；小脑内SNAP-25表达水平未受影响[9]，差异原因尚不明确。有研究[10]显示SNAP-25增多可能与甲减时裂解SNAP-25的钙蛋白酶减少有关。另一研究[11]表明SNAP-25改变可能与SNARE复合体相关的突触结合蛋白(syt-1)有关。

L-T4替代治疗是目前治疗甲减的标准方案，目标是使T3、T4、TSH恢复至正常水平。本试验给予L-T4替代治疗2周后，L-T4组大鼠血清甲状腺素水平与CON组比较差异无统计学意义；尼氏染色显示L-T4组大鼠PCC内尼氏体较Hypo组数量增加，未能恢复至CON组水平。免疫组化显示L-T4组大鼠PCC内SNAP-25蛋白表达水平较Hypo组下降，未恢复至CON组水平。这提示L-T4替代治疗2周后，甲减大鼠PCC内尼氏体数量和SNAP-25蛋白表达均未能恢复至正常水平。Quintanar et al[12]给予T4替代治疗20 d后，甲减大鼠垂体的SNAP-25表达未恢复正常。也有研究[13]显示给予大剂量L-T4(20 μg/100 g体质量)替代治疗2周，额叶内SNAP-25能够有效恢复，甲状腺素可能是通过与甲状腺素受体结合发挥调节作用[9]，大剂量L-T4替代治疗能够充分与甲状腺素受体结合发挥作用；但其血清甲状腺素显著高于正常对照组，存在甲亢的风险。

本研究尝试寻找完全修复甲减导致的PCC尼氏体和SNAP-25表达损伤的可能性。多奈哌齐是一种胆碱酯酶抑制剂，广泛应用于阿尔兹海默症的临床治疗。实验研究[5]表明其具有神经保护作用，本实验尝试给予多奈哌齐单独治疗，尼氏染色显示DON组大鼠PCC内尼氏体较Hypo组数量增加，提示多奈哌齐能够在甲减大鼠中发挥神经保护作用。本实验尝试给予L-T4+DON组大鼠L-T4联合DON治疗后，PCC尼氏体AOD值与CON组比较差异无统计学意义,尼氏体数量恢复；PCC内SNAP-25表达水平与CON组比较差异无统计学意义。多奈哌齐能够增强神经再生[14]，有研究[15]表明多奈哌齐能够显著减少炎症因子分泌和表达。提示L-T4+DON组大鼠PCC尼氏体数量和SNAP-25表达恢复可能与多奈哌齐的神经保护及炎症抑制作用有关。

综上所述，甲减可引起后扣带回内SNAP-25表达增高和尼氏体损伤，L-T4替代治疗和多奈哌齐单独治疗均未能使后扣带回SNAP-25表达和尼氏体损伤完全恢复,L-T4联合多奈哌齐治疗能够使后扣带回SNAP-25表达和尼氏体损伤恢复至正常水平。提示L-T4与多奈哌齐联合治疗有利于修复甲减引起的后扣带回SNAP-25表达异常和尼氏体损伤。

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