刘丹

摘要：叶绿素a检测是生物监测水质和评价藻类生物量的重要指标，但是从当前实际情况来看，水质中叶绿素a检测方法存在研磨损失问题。文章总结分析了反复冻融法、超声波法、热乙醇法等改进方法，为如何优化水质中叶绿素a的提取方法进行策略分析。

关键词：水质；叶绿素a；提取方法；优化分析

叶绿素a是地表水监测的常规项目，是评价水体初级生产力和水体富营养化的重要指标。目前环境监测实验室主要采用的是《水和废水监测分析方法》（第四版）（以下称第四版）中《叶绿素a的测定方法—丙酮研磨提取法》和2017年12月21日环境保护部首次发布的《叶绿素a的测定 分光光度法 HJ 897-2017》。两种方法都是采用研磨法作为提取方法，但在大量的实际研究工作中发现，研磨可能导致叶绿素a的损失。目前，已有研究对标准方法中叶绿素a提取方法进行优化改进，如：反复冻融法、超声波法、热乙醇法等[1-3]。本文就上述几种提取方法的操作步骤、优缺点进行总结，为优化水质中叶绿素a检测方法进行分析。

一、研磨浸提法

研磨的内涵是破碎的细胞壁在丙酮溶液的作用下能够确保叶绿素a更容易被析出。HJ 897-2017规定，将样品滤膜置于研磨器中，加入3～4ml丙酮溶液研磨至糊状，并重复1～2次，保证充分研磨5min以上，在4°C避光浸提2～24h，离心取上清液，再用0.45μm聚四氟乙烯有机相针式滤器过滤上清液后测定。该方法在第四版的基础上进行了改进，减少了多次研磨、转移过程中样品的损失。但仍存在手动研磨费时费力、人为误差较大、研磨器表面附着等问题，不仅会造成叶绿素a提取不完全，长时间与有神经毒性的丙酮溶液接触也不利于实验人员身体健康。

二、反复冻融浸提法

反复冻融浸提法是利用细胞冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶胀以达到破碎细胞的目的。反复冻融—浸提法操作步骤分为冰冻、解冻、浸提三步，将滤膜放入黑色塑料袋或用锡箔纸包好，在-20°C和室温下反复冻融3～5次（冰冻时间为20min，解冻时间为5min），再放进10ml 90%丙酮溶液中震摇1min，4°C避光浸提20h后离心测定。

研究表明，反复冻融浸提法对叶绿素a的提取效果优于研磨浸提法[4]。不仅其有效减少了操作过程中样品的损耗，而且在显微镜下观察细胞破碎率达90%，明显高于研磨法[5]。因此反复冻融浸提法所测得的浓度水平较高，平行样品间的标准偏差也较小，重现性较好。同时，降低了试验人员与丙酮的接触时间。但反复冻融破碎的效果也因水体内藻类的不同而存在差异。陈明等发现，反复冻融—浸提法对微囊藻叶绿素a的提取效果优于小球藻[6]。这是因为前者细胞壁多由肽聚糖组成易破碎，而后者细胞壁中含有大量纤维组织，稳定性好，较难破碎。同时，该方法在实验过程中对滤膜的水分含量和反复冻融时间的掌握也尤为重要[7]。

三、超声波提取法

超声波提取法就是利用超声波的能量起到破碎细胞的作用。操作方法较为简单，即将滤膜置于有90%丙酮溶液的离心管中，于超声波仪破碎30min，然后定容、离心、待测。实验结果表明，超声波提取法测定所得的叶绿素a浓度水平是研磨提取法的1.08～1.57倍，提取效率明显提高[3]。同时，该方法也具有安全性高、系统操作误差小的优点。然而，与反复冻融—浸提法相似的是，该方法的提取效果也易受藻类细胞壁结构的影响[6]。

四、热乙醇浸提法

热乙醇浸提法在操作过程用安全的乙醇替代挥发性强的丙酮，在国际上采用率较高。该方法的原理是利用冷冻再热融过程引起细胞溶胀破碎，同时加热升温以增加乙醇萃取能力，从而使叶绿素a提取的更充分。操作步骤为将冷冻后的滤膜置于比色管中，迅速加入7～8ml 95%的热乙醇振摇，并水浴萃取1～2min，浸提后定容、离心测定。

研究發现，热乙醇浸提法对绿藻为主的水体中叶绿素a的提取效果较好，甚至优于反复冻融浸提法和超声波浸提法[6]。但也有研究表明热乙醇浸提法测得的叶绿素a含量与研磨浸提法所测数据无显著差异[3，8]。该方法优势在于样品损失小、安全性高，操作简单。然而，实验过程中，水浴的时间和温度控制尤为重要。温度过高，乙醇蒸发、叶绿素a的稳定性被破坏均会使实验结果偏低；温度过低则会造成提取不完全，使结果偏低。杨玉珍等在对水浴温度、浸提温度、浸提时间等实验条件进行比较优化后提出，抽滤后滤膜先冷冻8h以上，然后在80°C条件下水浴萃取，室温浸提12h以上提取效果更好[2]。也有学者认为90%丙酮比95%乙醇的穿透性更强、萃取效率更高，更能完全提出浮游植物的叶绿素a[8]。

结论：

综上所述，叶绿素a提取方法的改进主要是解决研磨过程中样品损失的问题。研究人员提出的反复冻融法、超声波法和热乙醇法改进策略操作简便、安全性高、重复性好、人为误差小，提取效果较好，但在实际操作过程中时间、温度、藻类种类等客观因素对叶绿素a的提取效果影响较大。因此针对不同的水体、不同实验条件选择或组成最佳的叶绿素a的提取方法可达到客观反映水体初级生产力和水体富营养化的目的。

参考文献

[1]黄莹波.浮游植物叶绿素a提取方法的改进：反复冻融-浸提法[J].中国科技信息，2012（10）：157-157.

[2]杨玉珍，夏未铭，杨瑾，等.水体中叶绿素a测定方法的研究[J].中国环境监测，2011，27（5）：27-30.

[3]李征，胡新跃.水质中叶绿素a检测方法的改进和探讨[J].科技传播，2016，8（12）.

[4]戴欣，杨航，石岩等.分光光度法测定水体中叶绿素a含量的改进[J].东北水利水电，2012，30（6）：32-33.

[5]韩彦霞，牟真.研磨法与冻融法测定湖库叶绿素a的方法探讨[J].中国水能及电气化，2018（2）.

[6]陈明，孙洁梅，李敏.水体中藻类叶绿素a提取方法的比较[J].环境监测管理与技术，2017（4）.

[7]林少君，立静，黄沛生等.浮游植物中叶绿素a提取方法的比较与改进[J].生态科学，2005，24（1）.

[8]黄昌妙，叶树才，王潮.浮游植物叶绿素a测定方法的比较分析[J].福建分析测试，2013，22（4）：23-27.

（作者单位：自贡市自流井区环境监测站）