韩艺娟　钟振晖　吴剑英　鲁国东　王宗华

摘 要 在侵染水稻过程中，稻瘟病菌分泌一系列效应因子来抑制寄主免疫系统。无毒效应因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有类LxAR基序，基于此，本研究利用生物信息学技术，从稻瘟病菌基因组中筛选获得了99个含有类LxAR基序的假定效应因子（MoLLEs）。该家族蛋白都为小分子蛋白（70～300 aa），富含半胱氨酸氨基，绝大多数为未知功能的蛋白。24个蛋白含已知的功能域，可能涉及了多种生命过程，其中有9个蛋白编码植物细胞壁降解酶。通过表达模式分析发现，MoLLEs家族基因成员的表达受到饥饿胁迫、附着胞生长发育以及侵染水稻等过程的诱导，此外一部分基因受到附着胞发育关键基因PMK1调控。基因表达交叉分析表明，部分基因同时在附着胞发育和致病过程中上调表达。在与水稻的相互作用中，MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同阶段均有上调表达，并且部分基因受亲和或非亲和反应特异性诱导。

关键词 稻瘟病菌；LxAR效应分子；生物信息学预测；附着胞；侵染；RNA-seq

中图分类号 S435.111.4+1 文献标识码 A

Abstract Rice blast fungus Magaporthe oryzae secrets effector proteins to suppress host immunity when infecting with rice. AVR Pii and AvrPiz-t， M. oryzae avirulence effectors， both contain LxAR motif， which leads us to predict and get 99 of LxAR like effectors （MoLLEs） from M. oryzae genome using bioinfomatics tools in this study. MoLLEs are rich in cysteine and encoded as small amount proteins by ranging from 70 to 300 amino acid residues. Most of the members in this family are hypothetical proteins and only 24 are annotated with domain information which may be involved in many life processes. Nine MoLLEs proteins are predicted as plant cell degraded enzymes. We analyzed the expression patterns of MoLLEs genes and found quite a number were upregulated upon nutrient limitations and appressorium development. In addition， MoLLEs genes were induced during infections with rice. Some MoLLEs genes were specifically up-regulated by compatible or incompatible interaction.

Key words Magnaporthe oryzae； MoLLEs effector； bioinformatic prediction； appressorium； infection； RNA-seq

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.023

在与病原菌的长期互作中，植物不断进化出一系列免疫机制来防御外界侵袭。目前为止，植物体存在2个层次的先天免疫系统，即病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern， PAMP）触发的免疫反应（PAMP-triggered immunity， PTI）和效应因子触发的免疫反应（effector-triggered immunity， ETI）[1-2]。PAMP是一类结构保守的小分子物质，如真菌几丁质、细菌鞭毛短肽flg22等，被细胞膜受体识别后，可诱发植物细胞氧爆发、胼胝质积累、防御基因表达等[3-6]。ETI是基于病原菌效应因子的高级免疫反应，符合基因-基因假说。植物中的R基因可直接或间接识别病菌中的无毒基因（Avr），激发更加强烈的过敏反应，使植物呈现抗病表型[1-2]。

为克服植物免疫反应，在侵染初期，病原菌通过分泌一些效应因子来干扰寄主受体的识别，致使植物感病，该过程称为效应因子触发的感病反应（effector triggered susceptible reaction， ETS）[1-2， 7-9]。细菌Ⅲ型分泌系统（Type III secretion system， T3SS）是目前研究得最清楚的ETS系统。病原细菌可借助T3SS将效应因子转运进植物细胞内，来破坏寄主免疫反应[10]。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）无毒效应因子AvrPto或AvrPtoB均可抑制番茄（不携带Pto基因）细胞程序性死亡，致使番茄感病。当细菌AvrPto或AvrPtoB被抗病番茄（携带Pto基因）识别时，寄主体内则产生细胞程序性死亡，表现出抗病的表型[11]。

相比细菌，大部分病原卵菌或真菌并没有TTSS，而是通过其特有的吸器或其他结构将效应因子运输到植物细胞内。卵菌效应因子N端基序RXLR（Arg-X-Leu-Arg，X为任意氨基酸）广泛存在疫霉属和霜霉属无毒效应因子中，这为无毒效应因子的鉴定提供了有力的遗传支持[12-14]。RxLR基序为部分卵菌效应因子识别植物细胞的一种定位信号。马铃薯疫霉（Phytophthora infestans）AVR3a和大豆疫霉（Phytophthora sojae）AVR1b的RxLR基序均可结合寄主植物细胞膜PI3P蛋白，进而将效应因子转运进植物细胞[14-15]。大部分卵菌RxLR效应因子可破坏寄主免疫力，主要表现为对细胞程序性死亡、防御基因转录等的抑制[14-15]。某些核心效应因子（如霜霉HaRxL23和大豆疫霉PsAvh73）还可抑制多种植物的防御反应[16]。在真菌稻瘟病菌中，效应因子通过Biotropic Interfacial Complex （BIC）结构进入水稻细胞（如效应因子PWL2和AvrPiz-t），或停留在Extrainvasive Hyphal Membrane （EIHM）作为质外体蛋白行使功能（如效应因子BAS4和Slp1）[17-21]。迄今为止，稻瘟病菌40多个无毒基因得到鉴定[22-23]，其中PWL2、AvrPita、Avr-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pii、Avr-Pia、AVR-Pik/km/kp[24]、ACE1[25]、AVR-Pikm[26]、AvrPi9[27]和AvrPib[28]等基因已被克隆。這些无毒效应因子序列多样性强、保守性较低，这给效应因子的预测增加了难度。尽管如此，但是AVR-Pii和AvrPiz-t序列编码了类似卵菌的RxLR基序，即LxAR（Leu-x-Ala-Arg，x为任意氨基酸））或是类LxAR基序[23，29]。除此之外，有报道预测稻瘟病菌基因组可能还编码一些含有LxAR基序的蛋白[23]，然而该部分基因的功能尚未有报道。

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻的主要病害。该菌还可侵染其他禾本科植物，严重威胁了粮食生产，因此研究其致病机理迫在眉睫。稻瘟病菌与寄主水稻的基因组已全部测序，加上易于进行基因操作和遗传分析，二者之间的互作机制逐渐成为病原菌与植物互作的主要模型之一[30-34]。本研究利用生物信息学技术获得了99个具有LxAR基序的假定效应因子（LxAR like effectors， LLEs），并对蛋白大小和结构域等进行分析，结合稻瘟病菌侵染阶段转录组数据，分析MoLLEs基因的表达模式，以期为进一步研究这些基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试稻瘟病菌的菌株为Guy11，将Guy11营养菌丝接种到酵母淀粉培养基（酵母粉2 g/L、蔗糖3 g/L、可溶性淀粉10 g/L、琼脂粉18 g/L）后置于26 ℃温度下生长；后将扩繁的菌丝体转接到产孢培养基（米糠40 g/L、琼脂粉18 g/L，pH 6.0），26 ℃光照培养[35]。

供试水稻品种为Pid3和TP309。对长至三叶一芯期的水稻进行稻瘟病菌接种后置于25 ℃环境保湿。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌MoLLEs家族蛋白的检索和鉴定 从稻瘟病菌基因组数据库（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/）下载全基因组蛋白序列，以SignalP 4.1 程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信号肽预测与分析[36]。利用MEME motif search（http：//meme-suite.org/）[37]获得含有LxAR基序的99个蛋白。利用NCBI Conserved Domains在线软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）[38]预测蛋白结构域。

1.2.2 稻瘟病菌MoLLEs家族蛋白系统演化分析 利用MAFTT （Multiple Alignment using Fast Fourier Transform）[39]对MoLLEs序列进行序列多重比对，后用FastTree构建maximum-likelihood进化树，所选模式为JTT+CAT[40-41]。再用itol在线软件对所得进化树进行编辑（http：//itol.embl.de/#）。利用PRALINE（http：//www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）对MGG_10780、MGG_15371、MGG_14965、MGG_16489氨基酸序列进行比对分析多重比对。

1.2.3 稻瘟病菌MoLLEs家族基因表达模式 将稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液分别接种水稻Pid3、TP309，并在接种24、36 h后取发病水稻样品，以营养菌丝为对照，分别提取总RNA，进行转录组测序。通过Tophat、Cufflinks、Cuffmerge法从获取的reads中提取外显子[42]。通过RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization）法计算基因表达丰度[43]，并以RPKM的形式，用R package Pheatmap绘制基因表达热图。为研究MoLLEs家族基因的潜在功能，本研究结合HT-SuperSAGE在线数据[44]（http：//cogeme.ex.ac.uk/supersage/），对MoLLEs家族基因在稻瘟病菌不同生长阶段下的转录表达情况进行分析。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌假定MoLLEs分泌蛋白序列的获得和性质分析

在前期研究中，本课题组预测了1 701个假定稻瘟病菌分泌蛋白[45]。在此基础上，本研究筛选并获得了99个含有类LxAR基序的效应因子，即MoLLEs（图1-A）。氨基酸长度分布分析显示，MoLLEs蛋白主要分布在100～250个氨基酸残基（aa）之间，其中，201～250 aa区间占28.3%，151～200 aa占22.2%，101～150 aa占21.2%，而小分子蛋白（<100 aa）占16.2%，251～300 aa占12.1%（图1-B），可见MoLLEs蛋白的序列符合稻瘟病菌效应因子小分子量的特点。已知无毒基因常含有多个半胱氨酸（Cys）残基，其组成的二硫键对效应因子的功能起重要作用。对MoLLEs蛋白半胱氨酸组成进行了统计分析（图1-C），结果显示：37% MoLLEs含有1～3个Cys残基；33%蛋白有4～6个Cys残基；16%蛋白含有7～12个Cys残基，其中3%的蛋白（MGG_00305、MGG_07900、MGG_10102）有10个Cys残基，2%的蛋白（MGG_05831、MGG_10557）有12个Cys残基。

对稻瘟病菌99个假定MoLLEs蛋白的功能域分析发现，仅有24个蛋白可预测到相关结构域信息，其余75个MoLLEs蛋白均为未知功能（表1）。9个已知功能域的蛋白可能参与降解植物细胞壁过程，如角质酶（MGG_02393、MGG_05798、MGG_09100）、β-1，4-木聚糖内切酶（MGG_08424、MGG_08331）、纤维二糖脱氢酶（MGG_00074）和果胶酯酶（MGG_14572）。其他MoLLEs蛋白参与的代谢途径比较广泛，例如糖代谢（MGG_17464）、脂肪代谢（MGG_08624、MGG_09333）、氨基酸代谢（MGG_02508）、DNA修复（MGG_16238、MGG_16551、MGG_13256）。MGG_00305的CVNH结构域来源于病毒外壳蛋白；MGG_08454编码类似疫霉NPP1（necrosis inducing protein）结构域，这两个蛋白可能与诱导细胞死亡相关。

2.2 稻瘟病菌假定MoLLEs家族蛋白序列进化分析

为更好了解MoLLEs家族蛋白与已知稻瘟病菌无毒蛋白之间的进化关系，对MoLLEs、AvrPiz-t、AVR Pii的氨基酸序列构建了进化树（图2-A）。根据演化特征，该进化树可分为6个分支（Clade1～Clade6）。 Clade1涵盖了植物细胞壁降解酶、甾醇C-8异构酶和酪氨酸酶等蛋白，其中4个未知蛋白（MGG_10780、MGG_15371、MGG_14965、MGG_16489）在进化上相对保守。对其进行多重序列比对分析，发现这4个蛋白之间同源较强（图2-B），说明该家族基因在进化过程中出现部分基因复制事件。在Clade2～Clade6中，MoLLEs蛋白序列呈现明显的趋散性，体现了该家族蛋白的多样性。然而Clade6也出现了一些与已知无毒效应因子同源性较接近的蛋白，MGG_17695、MGG_11397与AvrPiz-t的boottrap值在80%以上，MGG_17248、MGG_10556与AVR Pii较为靠近，boottrap值大于70%。

2.3 稻瘟病菌MoLLEs家族基因在生长发育阶段的表达模式

在99个MoLLEs中，39个MoLLEs基因无转录信息，60个MoLLEs受不同程度的诱导。在营养菌丝阶段，19个MoLLEs基因受到饥饿上调（以1.5倍为阈值）。在附着胞发育过程中，21个MoLLEs基因在附着胞形成早期（4～8 h）表达上调（图3-C～D）；33个MoLLEs在附着胞成熟（14～18 h）阶段表达上调（图3-A～B）。39个MoLLEs受到PMK1的调控，其中28个基因受PMK1正调控（图3-A、C），10个基因受到PMK1负调控（图3-B、D）。

经交叠分析，发现大部分受饥饿诱导的MoLLEs基因（14/19）在附着胞成熟阶段表达上调，其中7个基因也受PMK1正向调控（图3-A），即：MGG_03495、MGG_05798、MGG_07699、MGG_08331、MGG_09842、MGG_13256、MGG_14572；此外2個MoLLEs同时受PMK负调控（图3-B），即MGG_03042、MGG_08624。

相比附着胞成熟阶段，只有少数饥饿诱导的MoLLEs基因（3/19）在附着胞发育初期表达上调（图3-C～D），即MGG_04452、MGG_09333、MGG_10280；另外7个受PMK1正调控的MoLLEs也在该阶段上调表达（图3-C），即MGG_07824、MGG_08454、MGG_11397、MGG_14388、MGG_14641、MGG_14830、MGG_15374。然而，尚未发现有MoLLEs基因同时受饥饿、PMK1正调控并且在附着胞发育初期上调表达。4个附着胞发育初期上调表达的MoLLEs基因受PMK负调控（图3-D），即：MGG_00074、MGG_08041、MGG_08275、MGG_10024。

2.4 稻瘟病菌MoLLEs家族基因在侵染阶段的表达模式

利用RNAseq进一步分析在不同互作模式下MoLLEs家族基因的表达模式。将稻瘟病菌Guy11分别接种抗病水稻Pid3、感病水稻TP309，并以营养菌丝为对照，对不同接种时间段发病水稻叶片进行转录组测序。总体来看，大部分MoLLEs基因在菌丝阶段转录水平较低或者不表达，但超过70个基因在侵染阶段转录表达。

亲和与非亲和互作反应共同激活了一批MoLLEs家族基因的转录（图4），如MGG_04451、MGG_10080、MGG_10086、MGG_10280、MGG_12654、MGG_13108、MGG_15374、MGG_16327、MGG_16489、MGG_16647、MGG_17659、MGG_17767、MGG_17896。

在与水稻Pid3的非亲和反应中（图4），MGG_0074、MGG_05504、MGG_07871、MGG_15547、MGG_17767和MGG_18035在菌丝阶段不表达，在接种24 h后转录水平上升，而在接种36 h则无转录信号。此外，MGG_05429、MGG_08411、MGG_09842、MGG_09844、MGG_17406也有类似的表达模式，这些基因在接种36 h后表达水平下降。可见，这些MoLLEs基因可能参与稻瘟病菌侵染早期某些活动。但也有11个MoLLEs在接种后36 h才转录上调，如MGG_02508、MGG_03495、MGG_06861、MGG_07591、MGG_08331、MGG_08624、MGG_09848、MGG_09666、MGG_14572、MGG_14830、MGG_18141。其中MGG_03495、MGG_08331和MGG_14830仅在非亲和的36 hpi转录表达。

相对于Pid3抗病水稻，Guy11菌株与TP309水稻的感病反应也诱导了一些36 hpi特异表达的MoLLEs基因（图4），比如MGG_03760、MGG_05831、MGG_07699、MGG_09648、MGG_10065、MGG_12551、MGG_13256、MGG_13374、MGG_14388、MGG_17146和MGG_17464。据此推断，这11个MoLLEs基因可能参与感病反应侵染菌丝的扩展或该阶段的其他活动中发挥功能。

3 讨论

真菌病原菌通过分泌一些效应因子来抑制寄主免疫反应，从而实现成功侵染和定殖。一部分携带激发子功能的效应因子可诱导植物产生过敏性细胞坏死，另一部分效应因子则可抑制植物细胞坏死[46]。在稻瘟病菌中，至少10个效应因子被证实可引起植物发生细胞坏死，如MoHrip1[47]、MoHrip2[48]、Nep1[49]、MoNLP1[50]、MoNLP2[50]、MoNLP4[50]、MoCDIP1 [51]、MoCDIP2[51]、MoCDIP3[51]、MoCDIP4[51]、MSP1[52]、MoSM1[53-54]等。虽然这类蛋白在序列上相似性低，但对植物免疫力的影响类似，如MoHrip1、MoHrip2、MSP1、MoSM1可提高水稻的免疫力。无毒蛋白AvrPiz-t可抑制由BAX介导的细胞死亡[55-56]，并且AvrPiz-t转基因水稻对稻瘟病菌抵抗力较弱[56]。AVR Pii蛋白则可攻击氧化还原中间体，抑制寄主水稻细胞氧爆发[57]。AVR Pii含有类LxAR基序，基于此，本研究通过生物信息学方法得到了99个含LxAR基序的稻瘟分泌蛋白（MoLLEs）序列。大部分MoLLEs基因编码小分子未知蛋白，其氨基酸在70～300 aa之间。除了LxAR基序之外，含有已知功能域的MoLLEs编码了三大代谢（糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢）相关蛋白，其中有9个MoLLEs还编码了植物细胞壁降解酶，这预示着稻瘟病菌可能调用这类蛋白来降解水稻细胞壁以促进侵染。氨基酸的组成往往影响蛋白的功能，比如半胱氨酸构成的二硫键在维持蛋白结构上起重要作用。已知的多个无毒蛋白富含半胱氨酸，如AvrPiz-t[55]、AVR Pii[57]。其中AvrPiz-t成熟蛋白含有4个半胱氨酸，对其进行点突变导致AvrPiz-t丧失无毒功能[56]。本研究中，MoLLEs家族蛋白含有数量不等的半胱氨酸残基，以1～3个为主，4～6个次之，这与常见效应因子特征相符，然而他们的具体功能有待进一步研究。

从营养菌丝到分生孢子、附着胞，稻瘟病菌经历了不同生理形态的变化。这些过程离不开一系列基因的时空表达调控。MoLLEs家族蛋白数量众多，涉及多种类型蛋白，因此MoLLEs基因的表达模式可能与稻瘟病菌生长发育相关。从分生孢子萌发、附着胞形成，再到附着胞成熟、穿刺植物表层，这个过程营养匮乏，因此菌体必然启动抵抗饥饿机制，以保证菌体的正常发育。据Soanes等[44]报道，饥饿胁迫可能成为一种信号，使某些基因在附着胞发育阶段上调表达。除了饥饿胁迫之外，附着胞发育相关的磷酸激酶PMK1也是一个重要的方向指标。稻瘟病菌PMK1基因编码磷酸激酶MAP kinase，在附著胞生长发育和致病性中起重要作用[40]。PMK1调控多种生理活动，最终影响稻瘟病菌在寄主体内的定殖[44]。本研究分析了营养胁迫、附着胞不同发育阶段下MoLLEs家族基因的表达模式，发现绝大部分受饥饿诱导的MoLLEs成员（14/19）在附着胞成熟阶段（14～16 h）上调表达。在这些基因中，7个MoLLEs受到PMK1正向调控，2个MoLLEs受PMK1负调控向调控，2个MoLLEs受PMK1负调控。相比之下，在附着发育初期（4～8 h）则没有MoLLEs同时受营养胁迫和PMK1调控，由此可见，响应饥饿胁迫并受PMK1正向调控的MoLLEs可能参与附着的形态建成。

稻瘟病菌与水稻的相互作用模式符合基因-基因假说。本研究中大部分MoLLEs基因在菌丝阶段转录水平较低或者不表达，超过70个基因受侵染阶段转录表达。在稻瘟病菌Guy11菌株与抗病水稻Pid3的非亲和反应中，MoLLEs家族基因表达模式不尽相同。侵染菌丝形成阶段（24 hpi）和扩展阶段（36 hpi）均有特异表达的基因。而在亲和反应中，这些基因几乎不表达，推测这类家族成员可能在稻瘟病菌Guy11-水稻Pid3互作中起作用。在与水稻TP309的感病反应中，另外一部分MoLLEs在侵染36 h后转录上调，可能作为毒力因子来抑制水稻免疫反应。除此之外，亲和、非亲和反应也共同调控了一批MoLLEs基因，然而这些基因的功能有待于进一步分析与验证。

本研究分析了该家族蛋白的性质、演化特征及在长发育、致病过程中的表达特点，项目组将通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统、基因敲除等系统进一步筛选影响稻瘟病菌-水稻相互作用的家族成员，以期为稻瘟病菌致病基础提供理论基础。

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