王绪朋　赵辉　贾瑞宗　孔华　郭运玲　郭安平

摘 要 分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒（PRSV）最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据“致病菌衍生的抗病性”（PDR）原理，将病毒来源的基因全长序列，转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性，不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略，用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统，依据不同PRSV株系的保守序列分析结果，将5个sgRNA （2个CP sgRNA，2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA）串联在一个载体上，实现一个载体可识别剪切5个位点，从而达到广谱抗PRSV的效果，应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证，并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达，初步表现出对PRSV的抑制效果，这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。

关键词 番木瓜；CRISPR；番木瓜环斑病毒；广谱抗病；基因组编辑

中图分类号 S668.2 文献标识码 A

Abstract Molecular breeding is effective approach to develop resistance papaya against Papaya ring spot virus （PRSV）. Pathogen-derived resistance （PDR） was employed in the development of transgenic papaya. Fundamentally， PDR technology is sequence homology-dependent resistance， however， the genetic biodiversity of PRSV in Hainan is higher than other region in the world. To solve the PRSV problem in Hainan， we used the latest genomic editing technology CRISPR/FnCas9 assisted with Golden Gate vector system to construct 5 concatenated sgRNA （2 CP sgRNA，2 Nib sgRNAand1 HC-Pro sgRNA） on single vector， which can achieve the broad-spectrum PRSV resistance. In the later period， we can easily adjust or replace sgRNA according to the actual disease resistance， and deal with the complex problem of the papaya ring spot virus strain in Hainan. The vector has been sequenced and verified. The vector transiently expressed on leaves of papaya and showed a preliminary inhibitory effect on PRSV. This will lay a good foundation for obtaining broad spectrum resistance papaya varieties agatnst PRSV.

Key words papaya； CRISPR； papaya ringspot virus； broad spectrum disease resistance； genome editing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.019

番木瓜（Carica papaya L.）是中國和世界上其他热带地区最重要的消费和出口水果之一。番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是番木瓜生产上最大的限制因素，不抗病品种几乎绝产[1]。由于番木瓜本身缺少抗病种质，除转基因抗病育种外，目前尚无其它有效防治方法[2]。

在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下，现代生物技术方法被引入对PRSV的防治工作。1990年首例转PRSV外壳蛋白（Coat protein， CP）基因番木瓜问世[3-4]。1998年夏威夷转基因番木瓜“Rainbow”开始商业化应用，这是转基因技术在水果上的首次应用[5]。目前，被实际应用的番木瓜抗病毒基因多数来自病毒本身的基因，如病毒的外壳蛋白基因（CP）、复制酶基因（Replicate，RP，Nib）、成分辅助蛋白酶基因（Helper component-proteinase， HC-Pro）[5-6]。PRSV存在地理株系，不同地区的病毒株系差异大，番木瓜转基因育种研究发现转夏威夷或台湾PRSV外壳蛋白基因的品种仅对夏威夷或台湾的相近株系具有较好的抗性[4， 7]。近年来，本实验室对海南的PRSV病毒株系的种类与分布在分子水平上进行了研究，确认了在海南分布3种不同类型的PRSV株系（HainanⅠ、HainanⅡ和HainanⅢ）[8]，海南PRSV具有极高的突变率，在育种中需综合考虑以培育出广谱抗病的转基因品种[9]。

DNA组装方法是生物技术的基本工具，目前已有多种方法克隆DNA目的片段。在传统方法中，克隆构建载体通常需要几个步骤，相对繁琐。近些年来，发展出了一套新的一步克隆法——Golden Gate，其中ⅡS型限制性核酸内切酶有2个结构域，一个负责识别序列，另一个负责切割，非特异性地在识别位点下游进行切割[10-11]。Golden Gate克隆法是在同一反应体系中，利用ⅡS型限制性核酸内切酶在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的DNA片段，同时用连接酶将几个DNA片段按照既定的顺序连接，拼接成不含酶识别位点的DNA片段，使多个目的DNA片段按照设定的顺序实现“无缝”连接[12-13]。

本研究将编辑DNA双链的CRISPR/Cas9系统进行了改造，用FnCas9替换了Cas9的CRISPR/FnCas9系统可对RNA识别和切割。本研究对病毒不同株系和不同基因的保守区域进行分析，并设计了针对目标病毒不同基因的多个不同的gRNA，串联到植物表达载体中，对不同株系的PRSV病毒进行识别并切割其病毒RNA，达到广谱抗PRSV的目的，使番木瓜植株获得可遗传抗性，为培育广谱抗PRSV的番木瓜新品种奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 大肠杆菌DH5α化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。农杆菌AGL1化学感受态细胞购自北京天恩泽基因科技有限公司。载体pMOD_A0101、pMOD_B2301、pMOD_C0000、pTRANS_220d由美国明尼苏达大学Dan Voytas实验室合作提供。载体pMOD_A0101-Fn骨架来自pMOD_A0101，用FnCa9替换其中的Cas9基因，替换的基因依据发表序列[14]由生工生物工程（上海）股份有限公司基因合成。瞬时表达所用PRSV病毒株系为本实验室保存在-80 ℃的HainanⅠ、HainanⅡ和Hainan Ⅲ，番木瓜幼苗为非转基因品种台农二号。

1.1.2 酶类及主要生化试剂 限制性核酸内切酶LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；T7 DNA ligase购自New England Biolabs （Beijing） LTD；T4 DNA ligase购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PCR Master Mix購自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；Plasmid DNA Mini KitⅠ和Gel Extraction Kit购自Omega Bio-Tek公司；植物总RNA提取试剂盒TransZolTM Plant和RNA反转录试剂盒EasyScript Reverse Transcriptase购自全式金公司。其它试剂为国产分析纯。

1.1.3 引物 如表1所示，根据海南PRSV不同株系保守区域序列设计的sgRNA（小写字母）和载体序列（大写斜体字母），设计引物并加入SapⅠ、Esp3Ⅰ酶切位点（下划线部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司广州合成部合成。

1.2 方法

1.2.1 海南PRSV保守区域分析 在前期对海南PRSV株系鉴定分类的研究基础上，针对目前NCBI上面已上传的52条PRSV的3个关键基因（CP、Nib和HC-Pro）分别建立基因库[8]。用DNAMAN Version 7通过比较关键功能蛋白的氨基酸序列及其DNA序列，对基因库的同源性水平进行比较，软件参数参照Xiong等[15]。

1.2.2 sgRNA设计 分别依据3个基因库不同的同源性水平确定的保守区序列，用软件CasOT （http：//eendb.zfgenetics.org/casot/index.php）和sgRNAcas9 （http：//www.biootools.com/）设计识别PRSV的sgRNA，并分析其脱靶效益，最终确定5个sgRNA分别为>cp_r1：agcatccacagcttcattct；>cp_r2：acccagacaccagatatatc；>hcpro_r1：atgacacggaaacaagatta；>hcpro_r2：gtaattagcaaagaatcttt；>nib_r2：tcacaatagacccaaccatc。使用在线软件Multi-gRNA Array Assembly-Primer Design and Map Construction（http：//cfans-pmorrell.oit.umn.edu/CRISPR_Multiplex/assembly.php），将sgRNA序列导入，选择目标载体、启动子系统、限制性核酸内切酶、拼接系统，软件将会自动生成引物[16]。

1.2.3 PCR扩增目的片段 配置50 μL的反应体系，具体成分为：Plasmid DNA，0.5 μL；正反向引物各0.5 μL；2×PCR Master Mix，25 μL；Nuclease-free Water，23.5 μL。然后进行PCR反应程序：98 ℃/1 min+30 个循环（98 ℃/10 s+60 ℃/15 s+72 ℃/15 s）；72 ℃/2 min。对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，切胶，用试剂盒回收目的条带。

1.2.4 中间载体pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA构建 配置20 μL反应体系，具体成分为：60 ng质粒pMOD_B2301，25 ng PCR（PCR Reaction 1、PCR Reaction2、PCR Reaction3、PCR Reaction4、PCR Reaction5、PCR Reaction6）胶回收产物，2.5 U SapⅠ，5 U Esp3Ⅰ，3 U T7 DNA ligase，10 μL 2×T7 DNA ligas buffer，灭菌水加补足到20 μL。混匀后运行PCR程序如下：10个循环（37 ℃/5 min+25 ℃/10 min）。取5μL反应产物转化DH5α感受态细胞。37 ℃过夜培养，挑48个长势良好的单克隆菌落，液体LB中37 ℃培养6 h后，做菌落PCR筛选阳性克隆。挑选3～5个阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州测序部测序。测序结果用软件DNAMAN和SnapGene比对，确定5个gRNA已按正确顺序完整连入到pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA。对测序验证正确的阳性单克隆进行扩增培养，保菌，并提取质粒DNA，留作下一步实验之用。

1.2.5 组装CRISPR/FnCas9植物表达载体 配置20 μL反应体系，具体成分为：质粒100 ng pTRANS_220 d，120 ng质粒pMOD_A0101-Fn，150 ng质粒pMOD_B2301-PRSV-5sgRNA，150 ng质粒pMOD_C0000，0.4 U AarⅠoligonucleotide，1 U AarⅠ，5 U T4 DNA ligase，2 μL 10×T4 DNA ligas buffer，用灭菌水补足20 μL。PCR程序如下：37 ℃/5 min+16 ℃/10 min，10个循环；37 ℃/15 min，80 ℃/5 min。将20 μL反应产物全部转化DH5α感受态细胞。37 ℃过夜培养，挑取48个长势良好的单菌落，液体LB中37 ℃培养6 h后做菌落PCR筛选阳性克隆。挑选3～5个阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

3 讨论

规律成簇的间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats， CRISPR）是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式，在其基础上改造的CRISPR/Cas9系统的sgRNA部分具有与Cas9结合并定向识别DNA序列的功能，而Cas9则具有核酸内切酶的活性。2015年中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究团队在Nature Plants上发表利用CRISPR/Cas9类似免疫系统成功对抗植物DNA病毒的研究[14]。2015年《美国科学院院刊》PAN杂志发表一项利用CRISPR/Cas9系统对抗真核细胞RNA病毒的新研究，用一种来自弗朗西丝菌的Cas9酶（FnCas9）来识别剪切丙型肝炎病毒的基因组RNA，阻止了这一病原体在人类细胞中的复制[19]。已经有改造CRISPR/Cas9系统在烟草和拟南芥中实现了对RNA病毒进行编辑的报道，该研究在植物中表达FnCas9和能靶标黄瓜花叶病毒或烟草花叶病病毒的sgRNA，结果显示病毒感染症状明显减轻、病毒RNA的积累减少，进一步研究表明该抗病性状可稳定遗传到下一代[20]。

目前商业化应用的转基因抗病毒番木瓜主要采用RNAi技术，但该技术在广谱抗病毒方面优势不足。为了提高转基因番木瓜的广谱抗性，通过RNAi发夹载体与多个株系共同保守序列构建载体转化，可提高RNAi干扰效率。但受发夹载体构建技术的限制，转入的外源病毒片段在200～600 bp之间才有较好的效率，RNAi干扰技术不能一次转入太多株系的基因片段，这制约了干扰病毒基因的范围，达不到广谱抗病效果。因此，简单、灵活、高效的广谱抗RNA病毒株系的新技术有待进一步开发。基于CRISPR/FnCas9系统，根据海南番木瓜病毒不同株系关键基因设计短RNA引导序列（约20 bp），组成串联sgRNA（<100 bp），与FnCas9一起转化番木瓜，可能取得更好的广谱抗病效果。因此在CRISPR/FnCas9植物表达载体上增加一个串联sgRNA仅增加不到100 bp的核苷酸序列，即使增加10个病毒株系的特异引导序列，也不到1 000 bp的核苷酸序列，对植物表达载体的转化效率不会有太大影响，此外RNA引导序列需要的核苷酸数量很少，与RNAi载体构建比较，在载体设计上更简单、灵活、高效、经济、可操作性强。

本研究获得的工程菌株在番木瓜叶片上的瞬时表达中，农杆菌只能侵入叶片局部位置，故载体只能在叶片局部细胞中工作。PRSV在番木瓜上属系统性发病，在叶片的叶尖部位进行PRSV接种后，病毒顺着叶片扩散到整个植株。病毒在经过农杆菌注射的叶片基部时受到抑制，但带有载体的细胞数目有限，不能完全阻断病毒的扩散。本研究结果表明，注射工程菌株仅减缓了病毒的扩散和复制。想要真正达到完全抗病毒的效果需要进行番木瓜愈伤组织的遗传转化，获得转基因番木瓜株系。

本研究将基因编辑技术应用于番木瓜抗病育种，可能起到理想的抗病效果。将现有编辑DNA双链的CRISPR/Cas9系统进行改造，用FnCas9替换Cas9，改造后该系统有望可识别并切割RNA。同时依据对PRSV不同株系和不同基因的保守区域的分析，设计多个不同的gRNA，串联到植物表达载体pCRISPR-PRSV-5gRNA-FnCas9中，可对不同株系的病毒进行识别并切割其基因组RNA，真正实现广谱抗PRSV的目的。本研究已经对载体进行了测序比对验证，同时在番木瓜上进行了瞬时表达验证的初步证明，该载体能够抑制PRSV在番木瓜上的积累。目前正在进行番木瓜的遗传转化，以期获得广谱抗PRSV的轉基因番木瓜株系，为进一步培育广谱抗PRSV的番木瓜新品种奠定基础。

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