饶丽莎　官清娜　林思祖　叶义全　许珊珊

摘 要 为了解天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase， AS）基因在杉木生长发育及逆境中的作用机制，以杉木种子及其萌发的幼苗为材料，利用RT-PCR和RACE技术获得杉木ASN基因的cDNA序列（ClASN1）和基因组序列，并对该基因在不同生长发育阶段和逆境胁迫下的表达模式和Asn含量变化进行分析。结果表明：ClASN1基因cDNA全长1 609 bp，编码443个氨基酸；生物信息学分析结果表明，该基因为含跨膜结构的不稳定亲水蛋白，无信号肽，定位于过氧化物酶体，具有多样的磷酸化位点；进化树分析结果显示，该基因与北美云杉和樟子松亲缘关系最近；ClASN1基因组序列全长3 210 bp，含10个外显子和9个内含子；qPCR结果表明，该基因从浸种24 h到幼苗期表達量呈上升趋势，且在干旱胁迫、铝胁迫和光暗处理下均可诱导表达；除铝胁迫24 h和持续光照24 h外，ClASN1表达模式与Asn含量的变化趋势相同，此结果表明ClASN1基因通过催化Asn的合成参与杉木幼苗的生长发育及胁迫响应。

关键词 杉木；ASN基因；克隆；表达分析

中图分类号 S791.27 文献标识码 A

Abstract In order to investigate the underlying mechanism of ASN gene of Cunninghamia lanceolata in the growth stages and under abiotic stresses， RT-PCR combined with RACE was employed to clone the complete cDNA sequence and DNA sequence from Cunninghamia lanceolata seedling， and the expression of ClASN1 gene and the Asn content under various growth stages and abiotic stresses were analyzed. The results showed that the complete cDNA sequence of ClASN1 was 1 609 bp， encoding 443 amino acids. The bioinformatics software predicted that ClASN1 protein was unstable and hydrophilic with transmembrane structure without signal peptide， located in peroxidase and with various phosphorylation sites. Anglicizing phylogenetic tree of ASN genes in different plants indicated that ClASN1 had the closest relative with Picea sitchensis and Pinus sylvestris. The full length of genomic ClASN1 was 3 210 bp， which contained 10 exons and 9 introns. qPCR results showed that the expression of ClASN1 increased with the time elapsed from seed germination to seedling stage， and was also induced under drought stress， aluminum stress and light dark stress， moreover， the general expression tendencies of ClASN1gene accorded with the content of Asn under various stages from seed germination to seedling growth and different stresses expect for aluminum stress 24 h and light stress 24 h. In conclusion， the above results suggested that ClASN1 may play a role in the various stages from seed germination to seedling growth and stress responses.

Key words Cunninghamia lanceolata； ASN gene； cloning； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.016

氮素是植物生长发育所必需的大量元素之一，同时也是植物体内许多重要生物大分子的组成成分，如核酸、氨基酸和蛋白质等，因此，它对植物的产量和品质的形成具有重要的调控作用[1]。在当前高投入的农业生产模式下，通过增施氮肥是获得植物高产的主要措施之一。但是，氮肥的过量施用不仅会显著增加生产成本，导致大量无机氮在土壤中积累，而且还容易造成资源浪费甚至引起一系列环境问题[2]。因此，在保证植物产量的前提下，研究如何通过提高植物对氮的同化/利用效率达到“减施增效”的目的，对于改善环境污染和实现农业的可持续发展具有重要意义。

植物从土壤环境中吸收不同形态的氮素如铵态氮（NH4+）、硝态氮（NO3-）及氨基态氮后，NO3-首先经相关还原酶还原形成NH4+，随后NH4+经过谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的作用催化形成谷氨酰胺和谷氨酸，它们是植物体内含氮化合物的前体，用于合成各种氨基酸[3]。植物天冬酰胺的合成主要通过天冬酰胺合成酶转移谷氨酰胺的氨基到天冬氨酸形成的。由于天冬氨酸具有高氮碳比（N：C=4：2）和强稳定性等特点，是植物韧皮部内有机氮存储和运输的理想产物之一，在调控植物体内氮同化与循环中扮演十分关键的角色[4]。因此，作为调控该产物合成的关键酶——天冬酰胺合成酶被认为在植物氮代谢和植物体内氮的源库关系调节中发挥着重要作用[5]。已有研究结果表明，在5个具有不同蛋白质含量的大豆种子中，幼苗叶片中天冬酰胺合成酶基因AS1的表达量与其种子中与天冬酰胺合成酶活性及种子中的蛋白质含量呈显著正相关[6]。周丽慧等[7]研究也发现不同籼亚种或粳亚种的水稻品种内，天冬酰胺合成酶基因OsAS的表达量与籽粒蛋白质含量存在一定的关联。Lam等[8]通过分子生物学手段直接证实了天冬酰胺合成酶在植物体内氮代谢和氮的源库关系调节中的重要作用，通过表达拟南芥天冬酰胺合成酶基因ASN1，显著增加了韧皮部中天冬酰胺的含量，促进了天冬酰胺从原组织（叶和茎）到库组织（花和果实）的运输，进而改善了拟南芥种子中氮营养的状况。此外，有的研究结果还发现天冬酰胺介导的氮代谢的调节在调控植物应对生物和非生物胁迫过程中同样发挥着重要的作用[9-10]。因此，开展氮素同化与利用相关基因的克隆和功能研究，有助于从更深层次阐明植物氮素同化利用的分子机制，为进一步利用分子生物学手段提高植物氮素利用效率提供理论依据。

天冬酰胺合成酶是广泛存在于植物体内的氨基转移酶家族成员，主要由一类由小基因家族所编码[11]。目前已从许多植物中成功克隆到天冬酰胺合成酶基因（Asparagine Synthetase，ASN），如在拟南芥[12]、烟草[13]、玉米[14]、桑树[15]、大豆[16-17]、小黑麦[18]、番茄[19]和水稻[20]等，但这些研究主要集中在一些草本植物中，而对于木本植物的研究较少[21]。杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国南方重要的速生用材树种，因其具有速生和材质优良等特点，在我国南方广泛种植[22]。由于我国南方林地土壤属于典型的富铁铝化酸性土壤，酸性土壤本身就不利于土壤中氮素的固持。此外，我国南方属于典型的亚热带季风气候，夏季高温多雨，还容易引起土壤中可利用性氮素淋溶损失[23]。因此，长期以来氮素缺乏是限制杉木人工林林分生产力提高的一个重要障碍因子。因此，选育氮高效杉木新品种，提高杉木对氮的吸收与利用效率，是未来一段时间内森林培育学家开展杉木速生丰产林培育的一个重要研究方向，而探明杉木对氮素吸收利用的分子机制是开展杉木氮高效品种选育和遗传改良的基础。因此，本研究以杉木优良家系实生幼苗为研究对象，通过分离和鉴定杉木天冬酰胺合成酶基因ASN1，并分析其在不同生长发育阶段及逆境胁迫下的差异表达情况及其与天冬酰胺（asparagine，Asn）含量变化之间的关系，以期为后续进一步揭示杉木氮素营养高效利用的分子机制和选育氮高效利用新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年3代杉木良种及其萌发的的实生幼苗，由福建省沙县官庄国有林场提供。植物基因组DNA提取试剂盒、TIANScript cDNA第一链合成试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司，SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 分别在浸种24 h、种子出芽、胚根伸长、幼苗4个阶段进行取样，用于qPCR分析。将萌发2周的杉木幼苗用1/2 Hoagland营养液培养2 d，然后分别进行干旱胁迫、铝胁迫和光暗胁迫，并取样进行qPCR扩增。干旱胁迫是用含有5% PEG-6000的1/2 Hoagland营养液进行0、6、12、24 h的胁迫处理，以不含5% PEG-6000的1/2 Hoagland营养液培养的幼苗作为对照。铝胁迫是用含1 mmol/L AlCl3·6H2O的1/2 Hoagland营养液进行0、3、6、12、24、48 h铝胁迫处理，结束时取样分析，以不含1 mmol/L AlCl3·6H2O的1/2 Hoagland营养液培养的幼苗作为对照。光暗处理是将在正常光照周期（16 h光照/8 h黑暗）生长的杉木幼苗分别进行0、12、24、48 h的持续光照处理和持续黑暗处理，同时以光照周期16 h光照/8 h黑暗为对照处理。

1.2.2 总RNA和DNA的提取及cDNA合成 采用改良的CTAB法[24]提取杉木总RNA，采用植物基因组DNA提取试剂盒提杉木DNA，用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电检测总RNA和DNA的浓度和纯度。根据TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行保守区cDNA合成，采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit说明书进行3'RACE和5'RACE的cDNA合成。

1.2.3 引物设计和PCR扩增 根据GenBank中已登录的与杉木亲缘关系较近的物种ASN序列设计简并引物用于保守区扩增，根据扩增测序得到的保守区序列分别设计3'RACE和5'RACE特异性引物，将获得的保守区、3'RACE和5'RACE序列进行拼接，并在其起始密码子和终止密码子附近设计1对引物，用于ORF框验证及基因组序列扩增。本试验所用引物名称及序列见表1。

保守区和5'RACE序列的PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，43～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s～2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

3'RACE序列的PCR反应条件：94 ℃变性30 s，72 ℃退火2 min，5个循环；94 ℃变性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，5个循环； 94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s ，72 ℃延伸2 min，20个循环。

1.2.4 目的片段回收、克隆和测序 采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行回收，连接至pGEM-T-Easy载体上，并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆子委托北京六合华大基因生物技术公司进行测序。

1.2.5 生物信息学分析 利用DNAMAN和ORF Finder软件对克隆获得的天冬酰胺合成酶基因核酸序列进行拼接和开放性阅读框预测。使用在线软件对天冬酰胺合成酶基因所编码蛋白的理化性质（ExPASy Protparam）、亚细胞定位（Psort）、信号肽（SignaIP 4.1 Server）、跨膜结构（ExPASy）、磷酸化位点（NetPhos 2.0 Sever）、卷曲螺旋结构（EMBnet Coils）、二级结构（GOR IV）、三级结构（SWISSMODEL）进行预测和分析。利用GSDS软件预测内含子和外显子的位置和数量。利用MEGA5.02（临位相连法）构建系统进化树。

1.2.6 qPCR扩增与分析 本研究采用SYBR Premix Ex Taq试剂和罗氏LightCyclerRNano儀器，以杉木β-actin基因为内参基因，β-actin-F和β-actin-R为qPCR上下游引物，采用3步法，分析杉木ANS基因在不同生长发育阶段、干旱胁迫、铝胁迫和光暗胁迫下的表达情况。相对表达量的算法参照[25-26]的方法进行计算。

1.2.7 杉木Asn含量分析 采用酶联免疫分析法对不同生长发育阶段、干旱胁迫、铝胁迫和光暗处理下杉木Asn含量进行测定。

1.3 数据处理

采用Origin Pro 8.5对实验数据进行整理及绘图，并用SPSS 19.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 杉木ASN基因的cDNA全长序列扩增

以杉木cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，测序得到323 bp的保守片段（图1-a）。以引物GSP1和GSP2分别进行RACE试验，测序分别获得了652 bp的3'序列和893 bp的5'序列（图1-b、c）。利用DNAMAN软件将所获得的3段序列进行拼接，得到1 609 bp的杉木ASN基因cDNA全长。进一步利用引物F2和R2进行ORF验证，测序得到1条与拼接结果相同的1 332 bp的ORF序列（图1-d）。将该转录本在NCBI上进行核酸序列和氨基酸序列比对，显示该转录本与北美云杉、樟子松等已登录的多种植物ASN基因高度同源，证明已获得1 609 bp的杉木ASN基因cDNA全长，其中5'UTR为127 bp，3'UTR为150 bp，开放阅读框为1 332 bp，编码443个氨基酸，将这个转录本命名为ClASN1。

2.2 杉木ClASN1基因组序列扩增及内含子分析

以杉木DNA为模板，用ORF引物F2和R2进行PCR扩增，测序得到ClASN1基因组的全长3 210 bp（图1-e），将该序列与ORF的cDNA序列进行比对，除了内含子，其他序列完全一致。因此，所得序列为ClASN1基因的DNA序列。GSDS在线分析结果表明，该基因由10个外显子和9个内含子组成，所有内含子的剪切位点符合GT-AG规则，所得序列结构见图2。外显子长度分别为73、95、162、81、222、137、81、87、108、288 bp，平均长度为133 bp；内含子长度分别为208、100、102、114、347、127、129、544、108 bp，平均长度为198 bp，其中最长为544 bp，占该基因组长度的17%。

2.3 杉木ClASN1基因的生物信息学分析

利用在线生物软件对ClASN1基因所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析，结果发现ClASN1蛋白相对分子质量为49.4 ku， pI等电点为6.68；该蛋白由20种氨基酸组成，以亮氨酸（Leu）和丙氨酸（Ala）含量最丰富，比例均为9.5%，带49个正电荷（Lys+Arg）和52个负电荷（Glu+Asp），总平均亲水性和不稳定系数分别为-0.294和41.57，为亲水的不稳定蛋白。

通过生物信息学预测分析结果表明，ClASN1蛋白定位于过氧化物酶体中，不含信号肽，为非分泌蛋白，且不具卷曲螺旋结构，在第66～86个残基之间具有1个N末端朝外由外向内的跨膜结构，但该蛋白的确切信息则需要进一步通过相应的实验予以验证。磷酸化位点分析结果表明，该蛋白共有26个磷酸化位点，分别为丝氨酸（Ser）13个、苏氨酸（Thr）9个和酪氨酸（Tyr）4个。GOR IV二级结构分析结果发现，该蛋白无规则卷曲和α-螺旋所占比例较大，β-折叠所占比例最小。SWISSMODEL三级结构分析结论与二级结构分析结论相符（图3）。

根据MEGA5.02临位相连法构建系统进化树，结果见图4，ClASN1基因与北美云杉和樟子松亲缘关系最近，与拟南芥、紫云英的关系较远。

2.4 杉木ClASN1基因的定量表达分析

2.4.1 杉木幼苗不同生长发育阶段ClASN1基因的表达分析 以β-actin为内参基因，分析ClASN1基因在杉木幼苗不同生长发育阶段（浸种24 h、种子出芽、胚根伸长、幼苗）的表达模式，结果见图5，ClASN1基因在4个生长发育阶段均有表达，且表达量随生长时间的增加而显著上升，其中在幼苗期表达量迅速增加，达到最高值，变化幅度大，说明ClASN1基因在该阶段表现活跃 。

2.4.2 干旱胁迫下杉木ClASN1基因的表达分析 利用实时荧光定量PCR分析干旱胁迫下ClASN1基因的表达情况，结果见图6，在干旱胁迫下，ClASN1基因整体表现出前期变化不明显后期表达量显著增加的变化趋势。具体来说，在干旱胁迫6 h时，ClASN1基因的表达量与对照组相比并无明显差异；当干旱胁迫12 h时，ClASN1基因的表达量快速且显著增加，为对照组的3.8倍；继续胁迫到24 h时，ClASN1基因的表达量继续增加并达到最大值，此时ClASN1基因的表达量为对照的4.7倍。由此可见，杉木ClASN1基因可受干旱胁迫的诱导表达。

2.4.3 铝胁迫下杉木ClASN1基因表达分析 由图7可知，铝胁迫下，杉木ClASN1基因的表达量均高于对照组，并表现出早期受诱导强烈表达，后期表达量有所下降并呈现波动变化，但仍高于对照的变化趋势。具体来讲，在铝胁迫前6 h，ClASN1基因的表达量显著上升，并在6 h时达到峰值，此时ClASN1基因的表达量为对照的26.8倍；之后当铝胁迫至12 h时，其表达量急剧下降；铝胁迫24 h时，其表达量又略有下降；而在铝胁迫48 h时，ClASN1基因的表达量又有所上升；但在胁迫后期 （12～48 h） ，

ClASN1基因的表达量均显著高于对照。由此可见，杉木ClASN1基因同样可受铝胁迫诱导表达，暗示其在杉木适应铝胁迫环境过程中扮演着重要角色。

2.4.4 光暗处理下杉木ClASN1基因表达分析 为进一步明确杉木ClASN1基因是否同样能对光照和黑暗产生响应，本研究进一步对持续光照和黑暗下杉木ClASN1基因的表达情况进行分析，结果见图8，持续光照12 h和24 h均可诱导ClASN1基因的表达量增加，且在12 h时表达量急剧上升，达到最高值，之后又迅速下降，当持续光照48 h时，ClASN1表达量甚至比对照组低。而持续黑暗处理下，ClASN1基因的表达量虽有所变化，但整体变化幅度小，当持续黑暗12 h时达到最高值，在暗处理后期（24～48 h）ClASN1基因的表達量逐渐降低，但在整个过程其表达量均显著高于对照处理，说明ClASN1基因在该黑暗条件下表达相对稳定，均受黑暗显著诱导。比较持续光照12 h和持续黑暗12 h时的表达量，可发现持续光照12 h的表达量显著高于持续黑暗12 h时的表达量，表明ClASN1基因对光照更为敏感。

2.5 杉木天冬酰胺Asn含量分析

采用酶联免疫分析法对不同生长发育阶段、干旱胁迫、铝胁迫和光暗处理下杉木Asn含量进行测定，结果如下：杉木种子浸种24 h、种子出芽、胚根伸长、幼苗4个生长发育阶段的Asn含量呈缓慢上升的趋势（图9），说明在杉木幼苗的生长阶段，随着幼苗的发育，植株代谢增强，需要大量的氮源，因而对天冬酰胺的需求也逐渐增加。干旱胁迫下，Asn含量整体呈升-降的变化趋势，胁迫期间Asn含量均高于对照组，且当胁迫12 h时达到最高值（图10）。铝胁迫下，Asn含量均高于对照组，整体呈升-降-升-降的变化趋势，其中6 h时Asn含量上升至最高值，12 h时有所下降，24 h时Asn含量又再度上升，随后48 h又下降（图11）。持续光照和持续黑暗下，Asn含量均明显高于对照组，持续光照或持续黑暗前24 h时，二者Asn含量基本一致，且12 h和24 h的Asn含量基本保持不变，稳定维持在较高水平；48 h时Asn含量有所下降，但持续光照下的下降幅度较大（图12）。

3 讨论

氮是植物生长发育所必需的大量元素之一，在改善作物品质提高作物产量中起着十分关键的作用。然而，氮素缺乏一直是我国南方富铁铝化酸性土壤上森林生态系统所面临的重要问题，它已成为制约我国南方杉木人工林林分生产力提高的主要障碍因子之一[27]。因此，选育氮高效杉木品种，提高杉木对氮的吸收利用效率已成为当前解决林地氮缺乏的有效途径之一。利用分子生物学技术开展氮素同化与利用相关基因的克隆和功能研究则有助于阐明杉木氮素同化利用的分子机制，可为进一步利用基因工程手段培育氮高效利用杉木品种提供理论依据。

本研究从杉木实生苗中克隆得到一个杉木天冬酰胺合成酶基因ClASN1，进化树分析结果表明該基因与北美云杉和樟子松亲缘关系最近。天冬酰胺合成酶作为植物体内氮代谢关键酶广泛参与植物体内各种生理过程，在调控植物体内氮的源库关系、种子萌发、抗逆及抗病中都扮演着重要角色[4， 28-29]。通常情况下，在种子萌发过程中，首先会将存储在胚乳中的营养物质活化供种子生长需要。早期研究表明，火炬松种子萌发12 d后，幼苗中的天冬酰胺含量占氨基酸总含量的比例由50%上升到70%[30]。Rozan等[31]也发现在扁豆类植物中天冬酰胺是其体内最重要的氨基酸，该类植物体内的天冬酰胺含量范围在18.96～62.24 mg/g之间，在扁豆种子萌发4 d后，其幼苗体内天冬酰胺占氨基酸总量的比例由0%上升到40%～50%。由此可见，种子萌发和植物形态建成过程中天冬酰胺是植物体内氮的主要运输形态之一，在调控种子萌发和植物形态建成过程中发挥着关键作用。此外，Wan等[6]研究表明大豆叶片的天冬酰胺合成酶基因AS1的表达量与天冬酰胺酶活及大豆种子中蛋白质含量呈显著相关。类似的结果在水稻中也有观察到[7]。Lam 等[8]通过分子生物学手段为天冬酰胺合成酶基因在调控植物体内氮的源库关系提供了遗传学证据，在拟南芥中过表达天冬酰胺合成酶基因ASN1，显著增强了从源（叶）到库（果荚）天冬酰胺的转运，增加了种子天冬酰胺及蛋白质的含量。上述结果表明，无论在种子萌发过程中的氮的活化还是在种子发育过程中氮的存储，天冬酰胺合成酶均在这些过程中扮演着关键角色。

本研究发现在杉木种子萌发成幼苗的不同阶段中，植物体内ClASN1基因表达量不断增加，与该结果对应的是其体内天冬酰胺的含量也在不断上升，二者表现出相同的趋势，这与前人的结果一致。该结果暗示在杉木从种子萌发到幼苗形态建成的不同阶段中，ClASN1基因介导的天冬酰胺的合成可能在该过程中具有重要的调控作用。除了种子萌发可诱导植物ASN基因表达，增加Asn含量外，研究表明ASN基因表达还受多种因素诱导，如光照、碳水化合物、盐胁迫和重金属胁迫等均可显著诱导该基因的表达[4]。ASN基因的这种复杂的表达调控模式暗示该基因可能在植物各种生理活动过程中扮演着不同角色。干旱胁迫和重金属胁迫诱导的ASN基因表达，在先前的研究中也有报道[32]。本研究也发现干旱胁迫能诱导杉木ClASN1基因的表达，与基因表达一致的是杉木体内Asn含量也显著增加，但到目前为止，干旱胁迫下诱导ASN基因表达的具体作用尚不完全清楚。一种可能的解释就是在这些逆境胁迫条件下植物的光合能力显著受抑，导致运输到库组织的碳水化合物减少，引起用于代谢的碳源不足，为维持体内碳氮平衡，植物氮同化能力也会相应下降，而蛋白质分解代谢就会增强，为植物呼吸和其他代谢等活动提供碳骨架[33]。与干旱胁迫结果类似，本研究中同样发现铝胁迫能显著诱导杉木ClASN1基因的表达，与基因表达趋势基本一致的是杉木体内Asn含量也显著增加，且它们含量均显著高于各自对照。

值得注意的是，本研究还发现在铝胁迫下杉木体内Asn含量出现一定的波动现象（如第12、48小时杉木体内Asn含量出现一定程度的下降），这种波动现象表明在逆境条件下杉木体内Asn含量处于动态变化过程，而这种Asn含量实时动态调控过程尤其对于逆境胁迫下植物的生长发育尤为关键，同时也暗示植物能通过不断整合自身发育和环境信号对相关基因的表达进行实时调控，进而实时调控相关酶活性和最终产物的含量，使植物更好地适应逆境胁迫。因此，这种Asn含量的波动现象从侧面证实了Asn代谢可能在杉木适应铝胁迫环境中扮演重要角色，而这有待后续研究进一步证实。此外，研究表明光照对ASN基因表达的调控比较复杂，一般而言，光能抑制ASN基因表达，而黑暗可诱导该基因的表达。但事实上，一些植物对光不敏感甚至光照能诱导ASN基因的表达[34-36]。本研究也发现光对杉木ClASN1基因表达的调控比较复杂，在光照早期表现出强烈的诱导，而在后期其表达量显著低于对照。与其它植物类似，黑暗均诱导ClASN1基因的表达。前人与本研究结果共同表明，光对ASN基因复杂的表达调控暗示该基因在响应光照的不同阶段扮演着不同的功能，至于杉木ClASN1基因在该过程中具体起着什么样的作用有待后续进一步的研究。

参考文献

[1] Krapp A. Plant nitrogen assimilation and its regulation：a complex puzzle with missing pieces[J]. Current Opinion in Plant Biology，2015，25：115-122.

[2] 李宗新，董树亭，王空军，等. 不同肥料运筹对夏玉米田间土壤氮素淋溶与挥发影响的原位研究[J]. 植物营养与肥料学报，2007，13（6）：998-1 005.

[3] 马雪峰，高 旻，程治军. 植物氮素吸收与利用的分子机制研究进展[J]. 作物杂志，2013，4：32-38.

[4] Gaufichon L，Reisdorf-Cren M，Rothstein S J，et al. Biological functions of asparagine synthetase in plants[J]. Plant Science，2010，179（3）：141-153.

[5] Lam H M，Coschigano K T，Oliveira I C，et al. The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants[J]. Annual Review of Pant Biology，1996，47（1）：569-593.

[6] Wan T F，Shao G H，Shan X C，et al. Correlation between AS1 gene expression and seed protein contents in different soybean （Glycine max [L.] Merr.） cultivars[J]. Plant Biology，2006，8（2）：271-276.

[7] 周麗慧，张昌泉，刘巧泉，等. 具不同蛋白质含量水稻品种中天冬酰胺合成酶基因的表达[J]. 基因組学与应用生物学，2009，28（1）：39-45.

[8] Lam H M，Wong P，Chan H K，et al. Overexpression of the ASN1 gene enhances nitrogen status in seeds of Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2003，132（2）：926-935.

[9] Hwang I S，An S H，Hwang B K. Pepper asparagine synthetase 1 （CaAS1） is required for plant nitrogen assimilation and defense responses to microbial pathogens[J]. The Plant Journal，2011，67（5）：749-762.

[10] Maaroufi-Dguimi H，Debouba M，Gaufichon L，et al. An Arabidopsis mutant disrupted in ASN2 encoding asparagine synthetase 2 exhibits low salt stress tolerance[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（6）：623-628.

[11] Gaufichon L，Reisdorf-Cren M，Rothstein S J，et al. Biological functions of asparagine synthetase in plants[J]. Plant Science，2010，179（3）：141-153.

[12] Wong H K，Chan H K，Coruzzi G M，et al. Correlation of ASN2 gene expression with ammonium metabolism in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2004，134（1）：332-338.

[13] Beato V M，Rexach J，Navarro-Gochicoa M T，et al. A tobacco asparagine synthetase gene responds to carbon and nitrogen status and its root expression is affected under boron stress[J]. Plant Science，2010，178（3）：289-298.

[14] Todd J，Screen S，Crowley J，et al. Identification and characterization of four distinct asparagine synthetase （AsnS） genes in maize （Zea mays L.）[J]. Plant Science，2008，175（6）：799-808.

[15] 潘宝华，潘 刚，方荣俊，等. 桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析[J]. 蚕业科学，2011，37（1）：1-8.

[16] 张 继，王相晶，于 丹，等. 大豆天冬酰胺合成酶β基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 东北农业大学学报，2013，44（7）：17-21.

[17] Wan T F，Shao G H，Shan X C，et al. Correlation between AS1 gene expression and seed protein contents in different soybean （Glycine max [L.] Merr.） cultivars[J]. Plant Biology，2006，8（2）：271-276.

[18] 張晓磊. 小黑麦天冬酰胺合成酶基因克隆及功能验证[D]. 石河子：石河子大学，2013.

[19] 吕琳慧. 叶位和天冬酰胺合成酶基因的抗病调控功能分析[D]. 杭州：浙江大学，2014.

[20] 程维舜. 植物天冬酰胺合成酶基因的抗病性调控功能分析[D]. 杭州：浙江大学，2011.

[21] 郝丙青. 小黑杨天冬酰胺合成酶基因AS功能的研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2016.

[22] 薛 爽，叶义全，饶丽莎，等. 杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选[J]. 四川农业大学学报，2017，35（2）：227-233.

[23] Qafoku N P，Van Ranst E，Noble A，et al. Variable charge soils：their mineralogy，chemistry and management[J]. Advances in Agronomy，2004，84：159-215.

[24] Chang S，Puryear J，Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1993，11（2）：113-116.

[25] Nolan T，Hands R E，Bustin S A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR[J]. Nature Protocols，2006，1（3）：1 559-1 582.

[26] Schmittgen T D，Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols，2008，3（6）：1 101-1 108.

[27] 李常诚，李倩茹，徐兴良，等. 不同林龄杉木氮素的获取策略[J]. 生态学报，2016，36（9）：2 620-2 625.

[28] Maaroufi-Dguimi H，Debouba M，Gaufichon L，et al. An Arabidopsis mutant disrupted in ASN2 encoding asparagine synthetase 2 exhibits low salt stress tolerance[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（6）：623-628.

[29] Xu Q F，Cheng W S，Li S S，et al. Identification of genes required for Cf-dependent hypersensitive cell death by combined proteomic and RNA interfering analyses[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（7）：2 421-2 435.

[30] King J E，Gifford D J. Amino acid utilization in seeds of loblolly pine during germination and early seedling growth （I. arginine and arginase activity）[J]. Plant Physiology，1997，113（4）：1 125-1 135.

[31] Rozan P，Kuo Y H，Lambein F. Amino acids in seeds and seedlings of the genus Lens[J]. Phytochemistry，2001，58（2）：281-289.

[32] Lea P J，Sodek L，Parry M A J，et al. Asparagine in plants[J]. Annals of Applied Biology，2007，150（1）：1-26.

[33] Wong H K，Chan H K，Coruzzi G M，et al. Correlation of ASN2 gene expression with ammonium metabolism in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2004，134（1）：332-338.

[34] Waterhouse R N，Smyth A J，Massonneau A，et al. Molecular cloning and characterisation of asparagine synthetase from Lotus japonicus：dynamics of asparagine synthesis in N-sufficient conditions[J]. Plant Molecular Biology，1996，30（5）：883-897.

[35] Hughes C A，Beard H S，Matthews B F. Molecular cloning and expression of two cDNAs encoding asparagine synthetase in soybean[J]. Plant Molecular Biology，1997，33（2）：301-311.

[36] Lam H M，Hsieh M H，Coruzzi G. Reciprocal regulation of distinct asparagine synthetase genes by light and metabolites in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，1998，16（3）：345-353.