陈晓慧 曾丽兰 徐小萍 王亚婷 张梓浩 陈裕坤 林玉玲 赖钟雄

摘 要 以龙眼胚性愈伤组织为材料，研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况，并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明：龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制；而在白光处理下，Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势，在绿光中，则是先下调再上升。在盐胁迫处理下，Mn-SOD基因的表达受到抑制，在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内，外源激素IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达，提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明，龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于CaMV35S启动子，但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示，3缺失的MSD-pro4（-669～-267 bp）启动GUS基因的能力最强，其次为5缺失的MSD-pro1（-669～-1 bp），最弱的为MSD-pro2（-432 ～-1bp）和MSD-pro3（-267～-1 bp），提示Mn-SOD启动子-669～-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件；而-432～-1 bp区段含有负调控元件。

关键词 龙眼；Mn-SOD；启动子；瞬时表达

中图分类号 Q785； Q789 文献标识码 A

Abstract Expression of Mn-SOD was analyzed in embryogenic callus （EC） under abiotic stress and exogenous hormone treatment in Dimocarpus longan， and its promoter activities were studied in a tobacco transient expression system. Results showed that the expression of Mn-SOD was inhibited in longan EC treated by red and blue lights； Mn-SOD firstly increased and then decreased in white light treated-EC， and it has contrary expression pattern under green light treatment. The expression of Mn-SOD was inhibited under salt stress， and was not affected by sucrose and days treatment. In a certain range of concentration， exogenous hormones IAA， GA3， MeJA， SA and ETH could induce or inhibit the expression of Mn-SOD in longan EC， suggesting that longan Mn-SOD was involved in the response of exogenous hormones. Four deletions of longan Mn-SOD promoter fused to the GUS reporter gene were constructed and transient transformed into tobacco. The results showed that the activities of the four deletions of longan Mn-SOD promoter were lower than that of CaMV35S promoter， but all of them had the ability to activate the GUS gene. GUS activity and quantitative expression analysis both showed that 3' terminal deletion of MSD-pro4 （-420 bp） promoter is the strongest， followed by the terminal 5' deletions of MSD-pro1（-669～-1 bp）， and the weakest were MSD-pro2 （-432 ～-1 bp） and MSD-pro3 （-267～-1 bp）， suggesting that longan Mn-SOD promoter within the -669～-432bp region contains important positive regulatory elements， while the -1～432 region contains a negative regulatory element.

Key words Dimocarpus longan； Mn-SOD； promoter； transient expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.013

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是无患子科（Sapindaceae）常绿木本果树，是中国南方重要的亚热带特色水果之一，历史上有南方“桂圆”北“人参”之称。但在生长发育过程中，易受低温、干旱、盐害及环境污染等因子的影响，导致其代谢活动改变，生长发育受阻，甚至全株死亡。超氧化物歧化酶（Superoxde dismutase，SOD）是一种重要的抗氧化酶，广泛存在于生物体中，能有效的清除活性氧并减轻氧化胁迫。同时，SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线，在提高植物抗逆境胁迫等方面起着重要的作用[1-3]。根据活性中心所含金属离子的不同可将SOD分为3种类型：即铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）；并且SOD的调控形式因其存在不同类型而有所不同，其中Cu/Zn-SOD和Fe-SOD大多数是组成型表达，而Mn-SOD主要是诱导型表达[4]。课题组前期分离获得编码龙眼Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD的20个不同mRNA转录本，对它们的进化、基因结构及其在体胚发生过程中的表达进行了系统的比较分析[3]；此外，还进行了龙眼活体胚胎、体胚发生早期、不同温度处理及渗透胁迫（聚乙二醇（PEG）、甘露醇和蔗糖等）对龙眼胚性愈伤组织SOD酶活性的影响[5-6]。上述研究结果表明，SOD在龙眼生长发育和抗逆中均具有重要作用。

为进一步了解不同SOD类型在龙眼中的作用，本研究在前期研究基础上，以Mn-SOD基因为研究对象，研究其在非生物因子条件下和不同外源激素处理下的应答情况；在生物信息学分析基础上，通过5'/3'系列缺失法获得Mn-SOD基因5'上游片段4种不同的缺失片段，以pCAMBIA1301为载体，利用GUS基因作为报告基因，采用转化本氏烟的方法，对龙眼Mn-SOD启动子的结构和功能进行了初步的研究，以期为将来进一步解析龙眼Mn-SOD抗逆功能提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

‘红核子龙眼LC2胚性愈伤组织（EC）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）移栽苗、植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌LBA4404感受态均由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 龙眼胚性愈伤组织的非生物因子和激素处理 以旺盛生长的龙眼EC为试验基本材料，将其置于黑暗（对照）、红光、蓝光、白光、绿光下进行不同光质处理，分别收集培养24、72 h后的材料。以MS培养基为对照，取生长状况良好的龙眼EC分别接种于盐NaCl（10、15、20 g/L）、蔗糖sucrose（20、30、50、70、90 g/L）、生长素类似物IAA（0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L）、赤霉素GA3（3、6、10、12、25 mg/L）、茉莉酸甲酯MeJA（50、75、100、150 μmol/L）、水杨酸SA（50、75、100 μmol/L）和乙烯ETH（10、30、50、100 mg/L）处理的MS培养基中，并将它们放置于25 ℃、110 r/min的摇床中，黑暗震荡24 h后取材。上述处理均重复3次，材料收齐后，经液氮中速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱，并用于龙眼Mn-SOD基因表达水平的检测。

1.2.2 龙眼Mn-SOD启动子5'和3'端缺失突变片段引物设计 采用PlantCARE和DNAMAN6分别对Mn-SOD启动子序列进行生物信息学分析和酶切位点的分析，并根据分析结果分别设计带有酶切位点的BamH I和NcoI的引物（表1）。

1.2.3 龙眼Mn-SOD启动子5'和3'端缺失突变瞬时表达载体的构建 通过PCR获得不同缺失片段的目标序列，并利用Gel/PCR Extraction kit试剂盒回收、纯化目的片段，TA克隆后测序。序列比对正确的克隆子，经双酶切，连接到切除35S启动子的pCAMBIA1301载体上，最后连接产物转化大肠杆菌，在含有100 mg/L Kan和100 mg/L Rif的LB培养基中筛选出阳性克隆子，通过菌液PCR检测和质粒酶切验证重组质粒的正确性。经验证正确的重组质粒，命名为p1301-Mn-SOD pro-GUS，并将构建好的重组质粒转化根癌农杆菌，表达载体构建示意图如图1所示。

1.2.4 农杆菌介导转化烟草的GUS活性检测 从制备好的带重组质粒的农杆菌菌液中，取1 mL接种于10 mL液体YEB培养基中（含100 mg/L Kan和100 mg/L Str ），28 ℃摇床180 r/min震荡培养12 h直至菌液浓度OD600值为0.5～0.6之间；5 000 r/min离心10 min收集菌体；将重悬液的菌液浓度用MS（含添加200 mol/L As和20 mmol/L MgCl2）调整至OD600值为0.8～1.0之间，28 ℃静置活化3 h后，利用无菌注射器将重悬液注射入烟草叶片，并做好注射部位标记。将侵染后和未经侵染的烟草植株置于25 曟和14/10 h光周期条件下培养72 h后，参考实验室前期的方法[4]进行GUS活性检测。

1.2.5 实时荧光定量PCR分析 首先，依照TriPure的说明书提取非生物因子處理的龙眼EC总RNA及Mn-SOD启动子不同缺失片段转化烟草叶片的总RNA。cDNA合成参照TAKARA公司的SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒。qPCR扩增采用Takara SYBR ExScript试剂和罗氏LightCycler 480仪器。qPCR反应体系和扩增程序参照实验室前期发表的方法[3]。以eIF-4a为内参基因[7]，分析不同非生物因子下的龙眼EC的Mn-SOD基因的定量表达情况；以18S rRNA为内参基因，分析Mn-SOD启动子5'/3'不同缺失片段转化烟草叶片后GUS基因的表达情况。Mn-SOD、eIF-4a和18S rRNA引物序列引自实验室前期发表的文章[6-7]。引物均由华大基因公司合成。引物序列、扩增效率及退火温度见表2。并采用Excel和GraphPad软件进行数据分析和图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同非生物因子处理下龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达分析

利用qPCR技术检测Mn-SOD基因在不同光质、不同NaCl浓度及不同蔗糖浓度处理下龙眼胚性愈伤组织中的表达情况，结果见图2。不同光质处理24 h下的龙眼EC中，以黑暗培养为对照，Mn-SOD在白光中的表达水平上调，而在红光、蓝光和绿光中的表达水平下调；随着光照时间延长至72 h，在红光、蓝光和白光中，Mn-SOD的表达水平显著下调，而在绿光处理中，其表达量则显著高于对照（图2-a）。综上所述，随着红光和蓝光处理时间的延长，Mn-SOD基因的表达逐步受到抑制；而在白光处理下，Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势，在绿光中，则是先下调再上升。提示Mn-SOD在不同光质处理中的应答机制可能不尽相同。不同NaCl浓度胁迫下，龙眼EC中Mn-SOD的表达水平呈下调趋势，在20 g/L时达到最低值，提示盐胁迫下Mn-SOD基因的表达受到抑制（图2-b）。在不同蔗糖浓度处理的龙眼EC中，Mn-SOD基因的表达量在50 g/L时下调，而在其他浓度下基本没变化，提示在一定浓度范围内Mn-SOD的表达不受高浓度蔗糖处理的影响（图1-c）。

2.2 不同激素處理下龙眼EC中Mn-SOD基因的表达分析

不同浓度IAA、GA3、MeJA、SA和ETH处理下龙眼EC中Mn-SOD基因的表达分析结果见图3。以对照（0）相比，低浓度IAA处理下（0.5、1.0 mg/L）龙眼EC中的Mn-SOD基因的表达受到明显抑制，而当浓度升高到1.5 mg/L时，其表达又显著提高，随着浓度进一步升高（3.0 mg/L），其表达量又明显下降（图3-a），提示Mn-SOD能够响应IAA的应答。在0～6 mg/L的GA3浓度处理下，Mn-SOD表达水平呈下降趋势，随着浓度进一步升高至10 mg/L时，其表达量又显著上升，而当浓度达到25 mg/L时，其表达量则显著下降（图3-b）。在0～150 μmol/L MeJA胁迫下的龙眼EC中，Mn-SOD基因的表达水平呈逐步递减趋势，提示MeJA在龙眼EC中可能负调控Mn-SOD的表达（图3-c）。在SA处理下，以0 μmol/L为对照，Mn-SOD在50、75 μmol/L处理下，其表达量显著上升，而当浓度升高到100 μmol/L时，其表达水平又急速下降，低于对照水平，说明其能够响应SA的诱导（图3-d）。在10 mg/L乙烯利处理下，Mn-SOD基因的表达水平显著下降，随着ETH浓度的逐步升高，其表达水平又明显升高，在浓度100 mg/L处理下达到最高（图3-e）。综上所述，在一定浓度范围内，IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能调控Mn-SOD基因的表达。

2.3 DlMn-SOD启动子不同5'/3'端缺失片段调控下的GUS瞬时表达活性

从GenBank中获取龙眼Mn-SOD 5'端调控序列，其长度约为700 bp（Accession No：FJ590954）。根据PlantCARE生物信息学分析结果，在其不同位置设计3条正向引物（MSD-up1～ up3），从Mn-SOD基因起始密码子ATG上游到ATG前一个碱基分别设计1条反向锚定引物MSD-down1，通过PCR扩增获得3个5'端调控序列的缺失突变片段，并分别命名为MSD-pro1～pro3（图4-a）。MSD-pro1片段长为669 bp，含有现有长度的所有顺式作用元件；MSD-pro2片段长约为432 bp，与MSD-pro1相比，缺少了2个as-2-box和1个ARE元件；MSD-pro3片段长约为267 bp，与MSD-pro2相比，缺少了MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian等4个元件；以MSD-up1为上游引物，在离ATG上游较远处设计1条反向锚定引物MSD-down2（-267 bp），通过PCR扩增获得3'端调控序列的缺失突变体，将其命名为MSD-pro4，其含有as-2-box、ARE、MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian等7个元件（图4-a）。将上述缺失片段正向插入双酶切后的含GUS基因，但无CaMV35S启动子的双元植物表达载体pCAMBIA1301上。

在瞬时表达试验中，采用GUS荧光活性检测法，分析Mn-SOD启动子不同3'/5'端缺失片段调控下的烟草叶片GUS瞬时表达，同时平行进行阳性和阴性对照。阳性对照（PC）为含有CaMV35S启动子融合GUS基因的pCAMBIA1301表达载体，阴性对照（NC）为空菌株LBA4404，MSD-pro1～pro3（5'缺失）和MSD-pro4（3'缺失）4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于CaMV35S启动子，但与阴性对照（NC）相比它们均可启动GUS基因的表达（图4-b）。其中活性最强的为MSD-pro4（-669～-268 bp，3'缺失），MSD-pro3（-267～-1 bp，5'缺失）和MSD-pro1（-669～-1 bp，5'缺失）次之，MSD-pro2（-432 ～-1bp，5'缺失）最弱（图4-b），提示MSD-pro4（-669～-268 bp，3'缺失）含有as-2-box、ARE、MBS、Box-W1、AT-rich element和circadian元件中具有正向调控Mn-SOD基因表达的顺式作用元件。

2.4 龙眼Mn-SOD启动子不同3'/5'端缺失片段调控下的GUS基因表达分析

采用qPCR分析龙眼Mn-SOD启动子不同3'/5'端缺失片段调控下的烟草叶片GUS基因的表达情况（图4-c），与CaMV35S启动子（PC）相比，结果发现MSD-pro1～pro3（5'缺失）和MSD-pro4（3'缺失）4个缺失片段启动子启动GUS基因的表达能力均较低，但与阴性对照（NC）相比均具有一定启动GUS基因的活性。此外，GUS基因的相对表达量的结果显示，MSD-pro4（-669～-268 bp）启动GUS基因表达的能力最强，而MSD-pro3（-267～-1 bp）启动GUS基因的能力最弱，MSD-pro2（-432 ～-1bp）和MSD-pro1（-669～-1 bp）启动下的GUS基因表达水平较为接近，GUS基因的表达结果与GUS瞬时活性检测结果总体上较为一致，均为MSD-pro4启动GUS基因的能力最强，但不一致的是，GUS瞬时活性最弱的为MSD-pro2（-432 ～-1bp），而GUS基因转录水平最低的为MSD-pro3（-267～-1 bp）。

3 讨论

3.1 龙眼Mn-SOD参与非生物因子和外源激素的应答

近年来，Mn-SODs在保护植物抵抗各种非生物因子中已有较多报道。如Mn-SOD能够响应热激、冷胁迫和干旱等胁迫的诱导，其中热激和冷胁迫处理均能诱导其表达[1]；而在干旱胁迫下，其表达量总体呈下调趋势[1-2]。在盐胁迫下，来自香蕉[1]、西红柿[2]、小麦[8]和黄瓜[9]的Mn-SOD基因的表达量均提高。Mn-SOD在蔗糖、果糖和麦芽糖处理的子叶中其活性最高[10]。而在本研究中，Mn-SOD基因的表达在盐胁迫处理下的龙眼愈伤组织中受到抑制，在蔗糖中在50 g/L时下调，而在其他浓度下则不受影响，与上述报道结果不甚一致，提示不同植物间Mn-SOD基因在非生物因子中的调控作用可能存在差异。龙眼Mn-SOD启动子中含有3个类型光反应元件，如GAG-motif 、MRE和as-2-box元件[3]。本研究结果进一步证实其能受光或光质的诱导。因此，龙眼愈伤组织中的Mn-SOD能够响应多种非生物因子的应答。

本研究顯示，在一定浓度范围内，IAA、GA3、MeJA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达，提示其参与外源激素的应答。然而前期研究显示龙眼Mn-SOD启动子中并未含有激素响应元件[3]，这可能是由于获得的启动子序列过短（约700 bp），导致一些真实存在的顺式作用元件未能得到预测。玉米体胚发育后期，干旱和外源ABA处理均能上调Sod3.2（Mn-SOD）和Sod4（Cu/Zn-SOD）的表达[11-12]。在香蕉中，Mn-SOD基因中的4个转录本（MSD1A-1D）的表达均受到外源激素ABA、GA3、IAA和SA的诱导，但其4个Mn-SOD成员中仅MSD1D含有1个激素应答元件[1]。综上所述，植物Mn-SOD并不富含激素响应元件，但其能参与应答多个外源激素的处理，提示其可能受到一些转录因子的调控，进而参与外源激素的应答。因此，Mn-SOD如何参与外源激素的应答机制还有待于进一步深入研究。

3.2 龙眼Mn-SOD启动子特性分析

SOD在转基因植株中的过量表达能不同程度地增强植物对逆境胁迫的抵抗能力。如Mn-SOD基因的过表达增强了烟草SOD活性，从而提高了其冷害的耐受性和下一年的产量[13]。将Mn-SOD转到烟草进行过量表达，结果发现转基因烟草增强了对质膜和光系统Ⅱ的保护作用和对除草剂引起的氧胁迫的耐受性[14]。将怪柳的Mn-SOD基因转入棉花中，结果发现在干旱条件下转基因棉花SOD活性、脯氨酸和可溶性糖含量均明显提高，而且净光合和生物量也提高了[15]。但也有研究表明SOD过量表达并未提高植株的抗氧化能力，如Mn-SOD在苜蓿叶绿体和线粒体中同时过量表达时，结果发现与非转基因苜蓿相比，转基因苜蓿并没有提高芽和贮藏器官的生物量[16]。可见，单独过量表达Mn-SOD基因，使植物增强在抗氧化系统以及植物抗逆性方面的效果往往是有限的。植物的生长发育和生命周期是基因差异表达的结果，通过启动子顺式作用元件和转录因子相互协调作用，进而调控基因在特定的时空或环境条件下的表达[17]。因此，鉴定SOD基因自身启动子的功能并应用于遗传转化，将为植物的抗逆性研究提供良好的基础。

本研究结果表明，龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于CaMV35S启动子，但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果均显示3'缺失MSD- pro4（-669～-268 bp）比5'缺失的MSD-pro1（-669～-1 bp）、MSD-pro2（-432～-1bp）和MSD-pro3（-267～-1 bp）启动GUS基因的能力强，而此区段（-669～-268 bp）内含有ARE、as-2-box、-MBS、Box-W1、AT-rich element、circadian等元件，说明这些元件中有可能存在具有提高基因转录水平的重要的顺式调控元件；也可能是由于缺失的区段（-267～-1bp）中含有一些负调控元件，因此，3'端缺失的MSD-pro4启动GUS活性的能力最强。

MSD-pro3（-267～-1 bp）的启动子片段长度最短且活性最弱，可能是由于该区段中缺失了一些重要的表达因子；并且该区段内含有干旱响应元件MBS、光响应元件MRE、GAG-motif[3]，也可能是因为该区段内存在负调控作用元件。定量结果显示，Mn-SOD基因在多种光质处理下的表达受到抑制，提示Mn-SOD基因中的光响应元件（MRE、GAG- motif）可能是负调控元件，进而导致MSD-pro3（-267～-1 bp）的启动活性最弱。

此外，本研究中龙眼Mn-SOD启动子片段仅700 bp，其长度远远低于启动子的有效功能区域（>2 000 bp），而龙眼基因组数据的公布[18]，将为进一步对Mn-SOD启动子功能的鉴定提供基础，也为进一步探究龙眼Mn-SOD基因的抗逆功能奠定基础。

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