李美英 金志强 杨小亮 贾彩虹 夏启玉 郭静远 贺萍萍 徐碧玉

摘 要 通过简并引物和降落PCR方法结合RACE（rapid amplification of cDNA end）技术在香蕉果实cDNA文库中获得2个14-3-3基因，分别命名为Ma14-3-3d和Ma14-3-3h，把Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i进行多重序列比对和同源性比较。结果表明：Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有较高的同源性，同时具有一定的差异性。遗传进化分析结果表明，Ma14-3-3d与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i同属于non-ε类14-3-3基因，Ma14-3-3h属于ε类14-3-3基因。RT-PCR分析结果表明，Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中差异表达， Ma14-3-3d在香蕉的根、茎、叶、花和果中均有表达，且在茎、叶和花中的表达量高于根和果；Ma14-3-3h在根、花和果中的表达量较高，而在茎和叶中的表达量较低。qRT-PCR分析结果表明，Ma14-3-3d基因的表达明显受乙烯的诱导，而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯处理与1-MCP处理的果实中表达量均很低，与果实成熟的相关性不明显。推测Ma14-3-3d可能与香蕉果实成熟密切相关，可能参与乙烯调控果实成熟过程中的生物合成与信号转导。

关键词 香蕉；Ma14-3-3d；Ma14-3-3h；成熟；表達分析

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

Abstract Two cDNAs homologous with 14-3-3 protein genes were obtained by screening cDNA library of banana fruit by degenerate primer， landing PCR and RACE （rapid amplification of cDNA ends） approaches， and they were designated as Ma14-3-3d and Ma14-3-3h， respectively. Multiple alignment and homology comparison of deduced amino acid sequences of Ma14-3-3d and Ma14-3-3h together with Ma14-3-3a， Ma14-3-3c， Ma14-3-3e， and Ma14-3-3i revealed that they shared high similarity and specificity. Phylogenetic analysis showed that Ma14-3-3d with Ma14-3-3a， Ma14-3-3c， Ma14-3-3e， and Ma14-3-3i belonged to the non-ε group 14-3-3 genes， while Ma14-3-3h was classed into the ε group. Expression analysis showed that Ma14-3-3d and Ma14-3-3h were differentially expressed in different organs of banana as determined by RT-PCR （reverse transcriptase-polymerase chain reaction）， Ma14-3-3d was expressed in roots， stems， leaves， flowers and fruits of banana， and its expression in stems， leaves and flowers was higher than that in roots and fruits； the expression of Ma14-3-3h in roots， flowers and fruits was higher， and its expression in stems and leaves was low. Expression of Ma14-3-3d was obviously induced by ethylene as determined by qRT-PCR analysis， while the expression of Ma14-3-3h in ethylene treated and 1-MCP treated fruits was very low， its correlation with fruit ripening was not obvious. It is speculated that Ma14-3-3d may be closely related to the physiological process of ripening of banana fruit， and may be involved in ethylene biosynthesis， regulation of fruit ripening and signal transduction.

Key words banana； Ma14-3-3d； Ma14-3-3h； ripening； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.012

香蕉是一种典型的呼吸跃变型果实，随着呼吸跃变的发生，果皮和果肉发生着复杂而又迅速的生理和生化变化，这些变化直接影响香蕉果实的品质、风味和货架期，从而影响了香蕉的商品价值[1]。近年来香蕉采后成熟的机制研究取得了巨大进展，这为人们更好地调控果实采后成熟技术措施提供了理论依据。

因为乙烯对果实成熟具有重要的调控作用，近年来与乙烯生物合成密切相关的酶基因如ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthetase，ACS）基因家族及ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）基因在香蕉果实中已被分离，研究证明MA-ACS1和MA-ACO1是与香蕉果实成熟密切相关的2个主要基因，对果实成熟过程中的乙烯生物合成起着直接的调控作用[2-4]。为了更深入研究香蕉果实采后成熟乙烯的生物合成调控机制，一些与果实成熟相关的转录因子CONSTANS（CO）[5]、MADS-box[6]被分离，与淀粉分解、糖的合成及细胞壁降解的一些酶基因，如α-淀粉酶（alpha-amylase）基因[7]、蔗糖磷酸合成酶基因[8]和果胶酶（Pectate lyase）基因[9]等也被分离，这些基因与香蕉果实成熟及乙烯生物合成的关系已被详细分析。

14-3-3蛋白是在真核生物体内广泛存在的一种高度保守的多基因家族蛋白，以同源或异源的杯状二聚体形式存在，通过接头或支架与发生磷酸化的多种目标靶蛋白的相应结构域发生相互作用，包括激酶、转录因子、结构蛋白、离子通道蛋白和病原菌反应相关蛋白，参与调控真核生物的许多生命活动过程，包括生长发育、囊泡穿梭运输、主要代谢过程、细胞周期循环、细胞调亡和生物及非生物胁迫反应以及许多激素的信号转导过程[10-14]。近年来，许多研究结果表明14-3-3蛋白与乙烯的生物合成密切相关，拟南芥14-3-3 psi基因在冷害刺激作用表达量升高，进一步的研究发现14-3-3蛋白通过调控乙烯生物合成酶的活性来控制内源乙烯的生物合成[15]，最近的研究結果发现拟南芥中的14-3-3蛋白可与3种结构型的ACS相互作用，可对植物体内内源乙烯的生物合成进行精细调控，从而调控着植物体内的多种生理过程[14-16]。前期的研究结果表明3个香蕉的14-3-3蛋白基因的表达与果实采后成熟密切相关，并受外源乙烯的强烈诱导[17]。

为进一步深入了解14-3-3蛋白对香蕉果实采后成熟的调控作用，本研究对通过简并引物结合降落PCR方法获得的2个14-3-3蛋白基因序列进行初步生物信息学分析，通过RT-PCR方法分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brizilian）不同器官中的表达水平，进一步运用qRT-PCR技术分析2个基因在香蕉果实采后不同时期、不同处理的表达变化。此结果为进一步研究香蕉14-3-3蛋白对果实成熟的调控机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

香蕉种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所澄迈基地，并进行正常管理。香蕉的根、茎、叶、花采自同一植株，果实饱满度为七成，采自与根、茎、叶和花生长发育一致的其它植株。采集的材料在液氮中快速冷冻并保存在-80℃冰箱中，用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 选取生长发育一致的3株植株，于开花60 d后果实成熟度为七成时进行采收，运回实验室，挑选大小一致、无机械伤害和病害的单果，在0.1%次氯酸钠溶液里表面消毒10 min，将消毒后的果实均匀分为3组分别进行3种处理：正常成熟、乙烯诱导及1-MCP（1-Methylcyclopropene， 1-MCP）处理。正常处理的果实置于22 ℃恒温条件下使其自然成熟；乙烯诱导果实首先放在一个密闭的容器内，并注射入100 μL/L的乙烯，22 ℃放置18 h后，开盖，放在22 ℃恒温条件下成熟；1-MCP抑制处理的果实首先用1 μL/L的1-MCP溶液在密闭的保鲜盒内处理24 h，然后取出在22 ℃恒温条件下成熟。每个处理选取45个果实。香蕉果实成熟不同阶段根据颜色变化可分为7个不同时期：全绿期（full green，FG）、黄色斑点期（trace yellow，TY）、绿多于黄色期（more green than yellow，MG）、黄多于绿色期（more yellow than green，MY）、绿色斑点期（green tip，GT）、全黄期（full yellow，FY）、全黄并有黑色斑点期（yellow flecked with brown spots，YB）[18]。按照成熟度划分的方法对不同处理的果实进行详细的观察，根据果实颜色的变化来确定果实的成熟度并进行取样。材料在液氮中快速冷冻并保存在-80 ℃冰箱中用于提取RNA。所有样品均至少进行3次重复取样。

1.2.2 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h基因的克隆及生物信息学分析 利用生物信息学的方法对模式植物的14-3-3家族的同源基因进行多序列比对分析，设计简并引物，以香蕉的不同器官RNA反转录的单链cDNA为模板，克隆14-3-3蛋白的其他家族成员。根、茎、叶和果RNA的提取方法参照改良的CTAB法，cDNA合成参照Promega的M-MLV Transcriptase反转录试剂盒说明书进行。Ma14-3-3h的克隆用简并引物，采用降落PCR程序，以香蕉果实的cDNA文库库液为模板获得，所用的简并引物序列为：P1：5′-NGARCARGCNGARMGNTAYG-3′，P2：5′-GANGTCCANARNGTNARRTTR-3′。Ma14-3-3d的克隆采用RACE技术获得[19]。

PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL，Mg2+（2.5 mmol/L）1.5 μL， cDNA单链1 μL，上游引物（10 pmol/μL）1 μL，下游引物（10 pmol/μL）1 μL，dNTP（dA/G/C/TTP：10 mmol/L each）0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，加水至总体积25 μL。

简并引物的降落PCR反应程序为：94 ℃变性5 min后，先进行10个循环的降落PCR反应，94 ℃变性50 s，退火温度由60 ℃降至50 ℃，每一个循环降1 ℃，时间45 s， 72 ℃延伸45 s；再以94 ℃变性50 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，进行30个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR扩增产物经回收后连接至T-vector PMD TM-18T（TaKaRa，Dalian，China）载体，克隆后进行测序，将所获得的序列运用NCBI Blastx （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行基因的同源比对分析。根据比对分析结果，采用5′RACE和3′RACE技术克隆扩增Ma14-3-3d的5′和3′末端，详见李美英等[19]的方法。

用Vector NTI9.0软件进行多序列比对分析，用MEGA5.01软件的邻位相连（Neighbor-Joining，NJ）法构建系统进化树。

1.2.3 RT-PCR 分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在不同器官中的表达 分别从香蕉的根、茎、叶、花和果实中提取总RNA，用Invitrogen SuperScripTM Ⅲ反转录酶合成单链cDNA，采用RT-PCR（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction）的方法分析香蕉14-3-3蛋白各基因在不同器官中的表达情况。香蕉果实actin基因为内参，正向引物和反向引物分别为5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′和 5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′。Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的引物序列见表1。PCR反应体系同1.2.2。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。

1.2.4 qRT-PCR分析Ma14-3-3d 和Ma14-3-3h在香蕉果实成熟不同时期的表达变化 分别从正常成熟、乙烯催熟和1-MCP抑制处理的不同时期的果实中提取总RNA，并按照1.2.3中的方法进行cDNA第一链的合成，在Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的非同源区设计基因特异性引物，以香蕉的actin基因作为内标[2]，以不同处理、果实成熟不同时期的cDNA第一链为模板进行qRT-PCR分析。引物序列见表1。qRT-PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA）0.5 μL、10 μmol/L的引物0.75 μL，cDNA模板1 μL，然后用水补足至20 μL。每个样品重复3次。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性7 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环，循环数结束后在94～56 ℃进行融解曲线分析。采用2-ΔΔΔCT相对定量方法分析基因表达量的差异。

2 结果与分析

2.1 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的序列PCR扩增分析

采用简并引物和降落PCR技术的扩增结果见图1，PCR扩增产物大小约为650 bp。BLASTx序列分析结果表明，有2个不同的14-3-3基因的同源cDNA片段，分别命名为Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h， 在Ma14-3-3d的基础上进行5′RACE和3′RACE，扩增Ma14-3-3d的5′和3′末端[19]。

2.2 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h基因序列的生物信息学分析

将Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与先前获得Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i的氨基酸序列进行多重序列比对，结果见图2。Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i有很高的同源性，也有一定的差异性，结果见表2。 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i与来自水稻和拟南芥的14-3-3基因进行遗传进化分析，结果表明Ma14-3-3d与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i同属于non-ε类14-3-3基因，Ma14-3-3h属于ε类14-3-3基因（图3）。证明了ε和non-ε类14-3-3基因存在于香蕉中，但香蕉的14-3-3基因與其它植物相比具有相似性和差异性。

2.3 Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h在香蕉不同组织器官的差异表达分析

运用RT-PCR分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中的差异表达，结果表明Ma14-3-3d在香蕉的根、茎、叶、花和果中均有表达，在茎、叶和花中的表达量高于在根和果中的表达；Ma14-3-3h在根、花和果中的表达量较高，而在茎和叶中的表达量较低（图4）。

M：Marker；R：根；Rh：茎；L：叶；Fr：果实。

M： Marker； R： The product of PCR in root； Rh： The product of PCR in shoot； L： The product of PCR in leaf； Fr： The product of PCR in fruit.

2.4 Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h在香蕉果实采后不同处理的表达分析

为了解Ma14-3-3d和Ma14-3-3h对香蕉果实成熟过程的调控作用，在香蕉采后成熟不同时期，采用qRT-PCR系统分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在乙烯催熟诱导和1-MCP处理抑制下的表达变化。结果表明，Ma14-3-3d在正常成熟的果实FG期表达量最高，在TY期表达量骤然下降，在MG时期表达量升高，随着果实的成熟，在正常成熟的其它阶段从MY期一直到YB期表达量逐渐降低。在乙烯催熟的果实中，Ma14-3-3d表达量逐渐升高，一直到MY期表达量达到最高，此后在GT期表达量下降，在FY和YB阶段表达量迅速下降。与正常成熟和乙烯处理果实的相比较，Ma14-3-3d在1-MCP处理果实的各个时期的表达均比较低，表明Ma14-3-3d基因的表达明显受乙烯的诱导（图5）。Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯处理和1-MCP处理的果实中表达量均很低，在正常成熟各时期的平均表达量为1.115 8，在乙烯处理各时期的平均表达量为0.574 0，在1-MCP各时期的平均表达量为0.826 8，表达量变化无明显的变化规律，因此Ma14-3-3h表达对乙烯的处理不明显（图5）。总之，Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉果实成熟过程表达变化差异比较明显，推测这2个基因在果实成熟过程中的作用可能不同。

3 讨论

14-3-3蛋白是真核生物中广泛存在的一类调控蛋白，通过识别多种靶蛋白的特异磷酸化序列而发生相互作用，参与调控真核生物的许多生命活动过程，且遗传进化分析表明来源于不同物种的14-3-3蛋白具有很高的同源性[10-11， 13-14]。本研究中，通过简并引物、降落PCR结合RACE技术克隆获得的几个香蕉14-3-3基因，并将推导的氨基酸序列进行了多重比对分析，结果发现Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、 Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有相似性且又有差异性。

植物的14-3-3蛋白在遗传进化上，可分为ε类和non-ε类14-3-3，在模式植物拟南芥和水稻中，ε类14-3-3基因为AtGF11、AtGF13、AtGF10、AtGF9、AtGF12、OsGF14g和OsGF14h，non-ε类14-3-3基因包括AtGF4、AtGF1、AtGF2、AtGF8、AtGF6、AtGF3、AtGF7、AtGF5、OsGF14f、OsGF14c、OsGF14d、OsGF14b、OsGF14e和OsGF14a[10]。本研究中，把在巴西蕉中克隆到的Ma14-3-3d和Ma14-3-3h与前期研究中的Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i与模式植物拟南芥和水稻中的14-3-3基因家族成员一起构建遗传进化树，结果发现Ma14-3-3d与Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i同属于non-ε类14-3-3蛋白基因， Ma14-3-3h属于ε类14-3-3蛋白基因。表明ε类和non-ε类14-3-3蛋白均存在于香蕉中，香蕉14-3-3基因序列的分析可为植物14-3-3蛋白在遗传进化方面研究提供新的资料。

植物具有应对外界不同刺激的反应能力，在应对刺激反应的过程中，某些基因的表达会发生强烈的变化。14-3-3基因家族不同成员在不同植物中的表达具有组织和器官特异性，如拟南芥的GF14 chi的启动子在根、种子、花的各种组织和发育的果实中有很强的活性[20]，水稻的14-3-3基因家族成员在不同器官和组织中的表达水平不同[21]。多种植物中转录组测序结果表明，植物的14-3-3家族成员在不同组织器官呈差异表达的特性[22-24]。本研究中发现Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉的根、茎、叶、花和果等器官中的表达有差异，表明Ma14-3-3d和Ma14-3-3h可能在香蕉不同器官发育中具有不同的功能。

香蕉是典型的呼吸跃变型果实，其采后成熟过程中出现呼吸跃变高峰，并伴有大量的乙烯产生，同时会引起很多生理生化变化，如淀粉转变为糖、多酚的降解和结构碳水化合物的酶解，这些变化都影响着果实的品质[1]。在香蕉果实成熟过程中发生的一系列生理生化变化与采后成熟过程中的基因差异表达密切相关[1]，如ACC合成酶基因[2-4]、ACC氧化酶基因[2-4]、蔗糖磷酸合成酶基因[8]。最近的研究结果表明，乙烯生物合成的关键限速酶ACS受14-3-3蛋白的调控[14-16]，另外在梨和番茄果实成熟过程中发现14-3-3蛋白基因表达显著升高[25-26]。为探索14-3-3蛋白基因对香蕉果实成熟的调控机制，本课题组前期分析了几个14-3-3蛋白基因在香蕉果实采后不同时期和不同处理情况下的表达变化，结果表明香蕉的3个14-3-3蛋白基因（Ma14-3-3a、Ma14-3-3c和 Ma14-3-3e）在果实采后成熟过程中受乙烯的强烈诱导，与果实成熟密切相关[17]。本研究详细分析了另外2个基因Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉采后不同时期和不同处理情况下的表达变化，结果表明Ma14-3-3d基因的表達明显受乙烯的诱导，而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯处理与1-MCP处理的果实中表达量均很低，与果实成熟的相关性不明显。推测Ma14-3-3d可能与香蕉果实成熟相关，也可能参与乙烯调控果实成熟的生物合成与信号转导。

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