张鸽 梁开朝 辛玉华 王娟 李书贵 王帆 张海波 刘好宝

摘 要：研究不同國家雪茄外包皮烟叶表面细菌差异，并为筛选菌株在雪茄外包皮烟叶发酵中的利用奠定基础。利用常规分离方法对美国、巴西、多米尼加及中国4个国家的7个雪茄外包皮烟样表面细菌进行分离鉴定，并初步测定筛选细菌的功能活性。结果表明，4个不同国家雪茄外包皮烟叶表面共分离获得细菌100株；属水平上不同地区雪茄外包皮烟叶表面细菌多样性及数量存在差异，基本以芽孢杆菌和葡萄球菌为主，尤其芽孢杆菌属为优势菌属；细菌种类多米尼加>美国-2=中国-1>巴西-1>巴西-2 >中国-2>美国-1。活性分析结果显示，具有纤维素酶、果胶酶和蛋白酶分泌功能的菌株分别为24株、20株和22株，耐烟碱菌株46株，有7株芽孢杆菌同时具有上述4种活性。本研究证明国内外不同地区雪茄外包皮烟叶表面细菌种类存在差异，以芽孢杆菌属为优势细菌，其次是葡萄球菌，且芽孢杆菌属酶活更全面，不同菌株间活性差异较大。

关键词：雪茄外包皮烟叶；表面细菌；分离鉴定；活性测定

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）02-0082-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.012

Isolation and Activity Determination of Surface Bacteria in Cigar Wrapper Leaves from Four Different Countries

ZHANG Ge1，2，3， LIANG Kaichao2， XIN Yuhua2， WANG Juan2， LI Shugui1，3，

WANG Fan4， ZHANG Haibo4， LIU Haobao1，2，3*

（1. Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China； 2. Hainan Cigar research Institute Hainan Provincial Branch of China National Tobacco Corporation， Haikou 571100， China； 3. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 4. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology， Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to study the difference of surface bacteria of cigar wrapper leaves from different countries， and lay the foundation for further research on utilization of bacteria in tobacco fermentation， surface bacteria from seven different regions， such as US， Brazil， Dominica and China， were isolated and bioactivities determined. The results showed that 100 strains of bacteria were isolated from different cigar wrapper tobacco. At the level of genus in different regions of cigar wrapper tobacco， surface bacterias diversity and numbers were different， and Bacillus and Staphylococcus were the main species. The microbial diversity at the level of genus gradually reduced from Dominica， America-2， China-1， Brazil-1， Brazil-2， China-2 to America-1. The results of bioactivity analysis showed that 24 strains had the ability to excrete cellulase， 20 strains had the ability to excrete pectinase， 22 strains had the ability to excrete protease， and 46 strains can grow in nicotine. Especially， 7 of the strains， which all belong to bacillus， had all four functions. This study showed that there were different species of bacteria on the surface of cigar wrapper in different regions. Bacillus was the dominant bacteria， followed by Staphylococcus. The activity of Bacillus was more comprehensive， and the bioactivity of different strains was different.

Keywords： cigar wrapper； surface bacteria； isolation and identification； activity determination

雪茄烟由3部分组成：茄衣、茄套和茄芯，其中茄衣是雪茄的精华部分[1]。由于生产水平差异，不同国家地区生产的雪茄外包皮烟叶品质不同，生产中对雪茄外包皮烟叶的物理特性要求较高。发酵

基金项目：海南省科技计划项目“海南省特色雪茄发酵微生物的分离与表征”（ZDYF2017155）；中国烟草总公司海南省公司科技重点项目“海南雪

茄烟叶常规发酵技术研究”（201746000024052），“优质雪茄外包皮烟叶关键栽培技术研究”（201746000024056）

作者简介：张 鸽（1992-），女，在读硕士，研究方向为烟叶发酵。E-mail：zhangge_0315@163.com。*通信作者，E-mail：liuhaoboa@caas.cn

收稿日期：2017-11-23 修回日期：2018-04-18

是改善雪茄外包皮烟叶外观质量、物理特性、内在成分、吸食品质的重要工序，是雪茄外包皮烟叶生产中的核心步骤[2]。氧化作用、微生物作用及酶作用是烟叶发酵三大机理，且随科技发展及研究深入，发现微生物在烟叶发酵中起着重要作用[2-3]，表现为微生物自身利用烟叶、微生物代谢产物作用于烟叶。不同研究者从不同烟叶表面分离的微生物种类存在差别，总体分为细菌、霉菌、放线菌及酵母菌4大类[3]，其中细菌占绝对优势，目前利用细菌促进烟叶发酵进而提升烟叶品质，缩短发酵周期的研究逐渐增多[4-5]。

国内雪茄外包皮烟叶发酵过程中的微生物研究已有报道[6]，但国内雪茄外包皮烟叶与国外优质雪茄外包皮烟叶品质差距较大，国内外雪茄外包皮烟叶表面细菌种类差异还未见报道，且目前可用于雪茄外包皮烟叶发酵，改善烟叶物理特性的菌株较少。基于以上问题，分析不同国家雪茄外包皮烟叶表面细菌种类，以及筛选菌株活性，对后期雪茄外包皮烟叶微生物发酵具有重要意义。本实验对取自美国、巴西、多米尼加及中国4个国家的7个地区雪茄外包皮烟样表面细菌利用常规分离方法进行分离鉴定，并对获得菌株进行功能活性鉴定，以期获得不同地区雪茄外包皮烟叶表面菌株的差异，并为筛选菌株在雪茄外包皮烟叶发酵中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 烟叶材料

烟叶材料来自4个国家，按其来源及地区不同将雪茄外包皮烟叶分别编号为：美国-1、美国-2、巴西-1、巴西-2、多米尼加、中国-1、中国-2。

1.2 细菌分离纯化及活性鉴定培养基

1.2.1 分离及纯化培养基 （1）牛肉膏蛋白胨培

养基为细菌筛选培养基。（2）烟叶培养基（补充培养基）：海南雪茄外包皮烟叶，高压粉碎：烟叶粉末20 g/L（沸水中煮20 min），琼脂15 g/L，自然pH，115 ℃高压灭菌30 min。（3）LB固体培养基为纯化培养基。

1.2.2 细菌功能活性分析培养基 蛋白酶活初筛培养基：酪蛋白水解圈法，参考文献[7]中的培养基成分配制。果胶酶活初筛培养基：刚果红染色法，参考文献[8]中的培养基成分配制。纤维素酶活初筛培养基：刚果红染色法，参考文獻[9]中的培养基成分配制。烟碱耐受菌株初筛培养基：利用含有烟碱的培养基[10]进行筛选。

以上所用试剂均为微生物培养常规试剂。

1.3 菌悬液制备及细菌分离培养方法

称取烟样1.0 g，置于含有50 mL 0.85%的无菌生理盐水中，37 ℃恒温摇床中振荡60 min，获得菌悬液，菌悬液梯度稀释获得涂布液：100，10-1，10-2，10-3，10-4五个梯度。将涂布液涂至筛选平板中，平板置于37 ℃的恒温培养箱中倒置培养，48 h后根据菌落形态将菌株划线至LB固体培养基中进行纯化筛选。

1.4 筛选菌株活性测定

利用1.2.2中筛选培养基进行筛选鉴定。具体操作：将分离纯化培养基中得到的细菌，分别点接至筛选培养基中，每个平板点接3个菌落，37 ℃培养箱中倒置培养24 h，培养结束后通过观察筛选平板中透明圈，根据透明圈有无判定菌株的活性。

1.5 筛选菌株鉴定

初步根据细菌形态进行筛选，再利用16S rDNA序列测序比对进行分子鉴定。所用引物为16S rDNA通用引物：27F（5' to 3'）：AGAGTTTGATCCTGGCT CG；1492R（5' to 3'）：ACGGCTACCTTGTTACGA CTT。

细菌鉴定体系（表1）。PCR程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR产物利用1%琼脂糖电泳检测，DNA片段大小符合理论大小PCR产物送至北京六合华大科技公司（http：//www.genomics.cn/index）测序，测序结果利用Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对获得菌株的初步鉴定结果。

表1 细菌鉴定体系表

Table 1 Bacteria identification PCR system

PCR体系 PCR system 体积/?L

Volume/?L

引物27F Primer 27F（10 pmol/?L） 0.5

引物1492R Primer 1492R（10 pmol/?L） 0.5

模板 Template 0.5

DNA聚合酶 rTaq enzyme（2×mix） 10.0

蒸馏水 dd H2O 8.5

总体积 Total Volume 20.0

2 结 果

2.1 属水平上7个地区雪茄外包皮烟叶表面细菌菌株的分离筛选

利用细菌筛选培养基，对4个国家7个地区雪

茄外包皮烟叶表面的易培养细菌进行分离鉴定，共筛选鉴定到100株细菌（表2），属于不同细菌种属，以芽孢杆菌属和葡萄球菌属为优势细菌，芽孢杆菌属共62株，葡萄球菌属共22株。不同地区的雪茄外包皮烟叶表面细菌种类有差异：美国-1和美国-2雪茄外包皮烟叶表面细菌种类以芽孢杆菌属为绝对优势微生物；其余烟样中，除芽孢杆菌属（Bacillus），葡萄球菌属（Staphylococcus）也占较大比重，葡萄球菌属是目前国内雪茄烟叶发酵中首次报道的细菌种类。供试烟叶中，以美国-1和中国-2雪茄外包皮烟叶表面易培养细菌种类及数量较少，分别为6种和7种；其余供试雪茄外包皮烟叶表面易培养细菌数量相差较小。此外，在美国-2和中国-1烟样中分离到少量不动杆菌；在巴西-1中得到少量泛菌属；巴西-1、中国-1和中国-2中分离到苍白杆菌属；巴西-2中还分离得到少量短杆菌和类芽孢杆菌。

2.2 四个国家雪茄外包皮烟叶表面细菌功能活性

烟叶中的细胞壁物质含量（如纤维素和果胶）对雪茄外包皮烟叶的物理性状影响较大。分离到细菌的纤维素酶活、果胶酶活、蛋白酶活以及耐烟碱

表2 属水平上7个地区雪茄外包皮烟叶表面细菌种类差异分析

Table 2 Diversity of surface bacteria of cigar wrapper at genus level in different regions

材料

Materials 菌株编号

No. 菌株种属

Species of strain 材料

Materials 菌株编号

No. 菌株种属

Species of strain

美国-1

America-1 1 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 巴西-1

Brazil-1 1 葡萄球菌Staphylococcus sp.

2 芽孢杆菌Bacillus sp. 2 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

3 芽孢杆菌Bacillus sp. 3 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

4 短小芽孢杆菌Bacillus pumilusstrain 4 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

5 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 5 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus

6 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 6 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus

美国-2

America-2 1 鲍氏不动杆菌Acinetobacter baumannii 7 鸡葡萄球菌Staphylococcus gallinarum

2 鮑氏不动杆菌Acinetobacter baumannii 8 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium

3 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 9 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium

4 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 10 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus

5 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 11 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus

6 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 12 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus

7 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 13 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis

8 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 14 嗜气芽孢杆菌Bacillus aerophilus

9 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 15 芽孢杆菌Bacillus sp.

10 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 16 肠泛菌Pantoea intestinalis

11 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 17 苍白杆菌Aeribacillus pallidus

12 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens 巴西-2

Brazil-2 1 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

13 巨大芽孢杆菌Bacillus meqaterium 2 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

14 巨大芽孢杆菌Bacillus meqaterium 3 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

15 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis 4 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

16 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis 5 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

17 高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 6 松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri

18 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 7 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis

19 特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis 8 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis

表2 （续）

Table 2 （Continued）

材料

Materials 菌株编号

No. 菌株种属

Species of strain 材料

Materials 菌株编号

No. 菌株种属

Species of strain

9 高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 15 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens

10 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 16 阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai

11 短杆菌Brevibacterium sp. 17 不动杆菌Acinetobacter sp.

12 类芽孢杆菌Paenibacillus sp. 18 不动杆菌Acinetobacter sp.

中国-2

China-2 1 腐生性葡萄球菌Staphylococcus saprophyticus 19 苍白杆菌Aeribacillus pallidus

2 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 多米尼加

Dominican 1 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

3 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 2 阿尔莱葡萄球菌Staphylococcus arlettae

4 纤维微细菌杆菌Cellulosimicrobium sp. 3 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

5 纤维化纤维微细菌Cellulosimicrobium cellulans 4 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

6 苍白杆菌Aeribacillus pallidus 5 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

7 短小杆菌Curtobacterium sp. 6 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis

中国-1

China-1 1 尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis 7 科氏葡萄球菌Staphylococcus cohnii

2 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium 8 巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium

3 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 9 芽孢杆菌Bacillus sp.

4 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 10 芽孢杆菌Bacillus sp.

5 短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 11 芽孢杆菌Bacillus sp.

6 芽孢杆菌Bacillus sp. 12 苏云金杆菌Bacillus thuringiensis

7 芽孢杆菌Bacillus sp. 13 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens

8 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 14 阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai

9 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 15 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis

10 沙福芽孢杆菌Bacillus safensis 16 沙福芽孢杆菌Bacillus safensis

11 弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus 17 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus

12 弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus 18 斯氏假单胞菌pseudomonas stutzeri

13 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 19 苍白芽孢杆菌Ochrobactrum sp.

14 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus 20 短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis

活性测定结果显示（表3），分别筛选到能分泌纤维素酶、果胶酶、蛋白酶及耐烟碱菌株24株、20株、22株及46株，共有7株芽孢杆菌同时具有所鉴定的4种功能活性。其中美国-2雪茄外包皮烟叶表面细菌的活性较全面，有5株芽孢杆菌同时具有4种功能活性；其他雪茄外包皮烟叶表面细菌活性鉴定结果活性较单一，尤其中国-2雪茄外包皮烟叶表面分离得到的细菌活性仅有4株具有耐烟碱活性，不具备其他所鉴定的活性；同一属间细菌活性差异较大。菌株功能活性的鉴定对后期雪茄外包皮烟叶的微生物发酵提供了菌株，也为菌株的进一步利用提供了研究方向。

3 讨 论

3.1 四个国家雪茄外包皮烟叶表面细菌差异

本实验利用常规分离方法，对4个国家7个地区的雪茄外包皮烟叶表面细菌进行分离，细菌数量及种类存在差异，其中芽孢杆菌属占比重最高，与杜佳等[11]的研究结果一致。但本研究中葡萄球菌數量所占比重较大，与目前报道的雪茄烟叶发酵中表面微生物种类有较大差异[11-12]：国内雪茄烟叶发酵微生物表征中，均为芽孢杆菌，未见葡萄球菌的报道。该结果可能与烟株的生长环境、烟叶所处的发酵阶段以及所采取的分离手段有较大关系，还可能由于芽孢杆菌属和葡萄球菌属是该发酵阶段的优势菌株，易于分离。但由于样品数量受限，不能全面反映国内外雪茄外包皮烟叶表面细菌种类差异。

此外，本实验利用常规分离方法对雪茄外包皮烟叶表面细菌进行分离存在较大局限性。自然界中可培养微生物仅占所有微生物的1%左右[13]，大量不可培养微生物在雪茄外包皮烟叶发酵中可能发挥重要作用。研究表明，陈化烟叶表面微生物种类和数量随着陈化时间而改变[14]。目前烟叶发酵中关于微生物演替的研究方法有：常规分离方法、

表3 四个国家雪茄外包皮烟叶表面细菌功能活性差异比较

Table 3 Comparison of the function activity of surface bacteria in different cigar wrapper

材料

Materials 菌株编号

No. 菌株活性

Activity of strain 材料

Materials 菌株编号

No. 菌株活性

Activity of strain

纤维素酶活

Cellulase 果胶酶活

Pectase 蛋白酶活

Protease 耐烟碱

Tolerance to

nicotine 纤维素酶活

Cellulase 果胶酶活

Pectase 蛋白酶活

Protease 耐烟碱

Tolerance to

nicotine

美国?1

American?1 1 ? ? ? ? 10 ? ? ? ?

2 ? ? ? + 11 + ? ? +

3 ? ? ? ? 12 ? ? ? +

4 ? ? ? ? 小计Subtotal 3 0 2 8

5 + ? ? + 多米尼加

Dominican 1 ? + ? ?

6 + + + + 2 ? ? ? ?

小计Subtotal 2 1 1 3 3 ? ? ? ?

美国?2

American?2 1 ? ? ? + 4 ? ? ? ?

2 ? + + + 5 ? ? ? ?

3 ? + ? + 6 ? ? ? ?

4 + ? + + 7 ? ? ? ?

5 + + + + 8 ? ? ? +

6 + + + ? 9 ? ? ? +

7 + + + + 10 ? ? ? +

8 + + + + 11 ? ? ? ?

9 ? + + + 12 + ? ? ?

10 + + + + 13 ? + + +

11 + ? ? ? 14 ? ? ? ?

12 + + + + 15 ? + + ?

13 ? ? ? + 16 ? + ? ?

14 ? ? ? ? 17 ? ? ? ?

15 + + + ? 18 ? ? ? ?

16 + + + + 19 ? ? + +

17 ? + ? ? 20 ? ? ? ?

18 + ? ? ? 小计Subtotal 1 4 3 5

19 ? + + + 中国-1

China-1 1 + ? ? ?

小计Subtotal 11 13 12 13 2 ? ? ? +

巴西-1

Brazil-1 1 ? ? ? + 3 + ? ? ?

2 ? ? ? + 4 + ? ? ?

3 ? ? ? + 5 ? ? ? ?

4 ? ? ? ? 6 + ? ? ?

5 ? ? ? ? 7 ? ? ? ?

6 ? ? ? ? 8 ? ? + +

7 ? ? ? + 9 ? ? + +

8 ? ? ? + 10 ? ? ? ?

9 ? ? ? + 11 ? ? ? +

10 ? ? ? + 12 ? ? ? ?

11 ? ? ? ? 13 ? ? ? ?

12 ? ? ? ? 14 + ? ? ?

13 ? + + + 15 ? ? + +

14 ? ? ? ? 16 ? ? ? ?

15 ? ? ? ? 17 ? ? ? ?

16 ? ? ? ? 18 + + ? ?

17 ? ? ? ? 19 + ? ? ?

小计Subtotal 0 1 1 8 小计Subtotal 7 1 3 5

巴西?2

Brazil?2 1 ? ? ? ? 中国?2

China?2 1 ? ? ? +

2 ? ? ? + 2 ? ? ? +

3 ? ? ? + 3 ? ? ? +

4 ? ? ? ? 4 ? ? ? +

5 ? ? ? + 5 ? ? ? ?

6 ? ? ? + 6 ? ? ? ?

7 + ? + + 7 ? ? ? ?

8 + ? + + 小计Subtotal 0 0 0 4

9 ? ? ? ? 共计Total 24 20 22 46

注：“+”表示阳性，有酶活；“?”表示阴性，没有酶活或酶活较小可忽略。Note：“+”positive； “?”negative， no enzyme activity or negligible.

DGGE[15]，限制性片段长度多态性技术[16]等。利用上述方法对烤烟发酵前后烟叶表面细菌群落变化进行了深入研究，但关于雪茄烟叶表面细菌群落演替研究较少。16S rDNA高通量测序技术，在细菌群落演替及种类分析中具有较大优势[17-19]。可采取高通量测序与常规分离相结合的方法，对烟叶表面细菌多样性进行更深入分析，以及对菌株种类进行更丰富的分离表征，以期对烟叶的微生物发酵机理及应用研究进行更深入研究。

3.2 筛选菌株活性测定结果分析

筛选细菌的酶活测定结果显示，芽孢杆菌属活性较全面，有7株同时具有所检测的4种活性。目前烟叶微生物发酵中，研究集中在添加芽孢杆菌提升烟叶品质[4]、降解烟叶成分以及烟叶增香提质等[7，10，20]，芽孢桿菌属在烟叶发酵中发挥重要作用。此外，本实验中分离得到较多葡萄球菌，但葡萄球菌的活性检测结果较差。有研究报道葡萄球菌属在腊肉香肠等发酵产香中发挥重要作用[21]。葡萄球菌代谢产生氨基酸，氨基酸与还原糖的美拉德反应是烟叶中香气物质的重要来源，葡萄球菌属在烟叶中的研究对烟叶发酵可能具有重要意义。

4 结 论

利用微生物常规分离方法对4个国家雪茄外包皮烟叶表面细菌种类进行分离鉴定及活性分析发现，不同地区雪茄外包皮烟叶表面细菌种类及数量有差异，主要以芽孢杆菌属和葡萄球菌属为主，且葡萄球菌属是目前国内雪茄烟叶研究中首次分离到的菌株。对分离细菌的功能活性分析结果显示，同一属间菌株的功能存在差别，芽孢杆菌属酶活性较全面，其他种属的细菌活性较差。本研究为雪茄外包皮烟叶的微生物发酵提供了菌株来源。

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