莫飞旭 喻会平 龙友华 吴小毛 黎晓茜 李磊

摘 要：为获得对烟蚜具有感染作用的虫霉菌，从贵州不同烟区采集受霉菌感染的烟蚜虫尸标本进行菌株分离，在室内进行感染率测定筛选获得优势菌株并通过rDNA-ITS序列测定，用菌丝生长速度法探索适宜虫霉菌生长的培养基、温度、光照和pH条件。结果表明，采集分离获得16株真菌，其中，感染作用较强的CM-4、CM-11和CM-15，在室内施用15 d后，对烟蚜的感染率分别达68.07%、69.80%和72.05%；通过BLAST在线比对CM-4、CM-11和CM-15 3株虫霉菌分别与金色毛壳菌（Chaetomium aureum）、渐狭蜡蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）同源性最高；CM-11和CM-15适宜在培养基E，CM-4适宜在培养基A条件下培养；CM-4和CM-15适宜温度为25～30 ℃，适宜CM-4和CM-11的光照为半光照半黑暗，pH为6～7。研究表明，金色毛壳菌、渐狭蜡蚧菌和少根根霉菌对烟蚜具有较强的感染作用，可用于烟蚜的生物防治。

关键词：烟蚜；虫霉菌；培养条件；生物防治；鉴定

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）06-0043-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.007

烟蚜[Myzus persicae （sulzer）]，又名桃蚜，是烟草重要的害虫之一，在世界范围内均有分布。烟蚜通过刺吸式口器吸取烟叶汁液，影响烟草正常的生理功能和生长，同时烟蚜还可排泄蜜露，引起霉菌滋生，污染叶片[1]，此外，烟蚜是病毒的重要传播媒介，可传播CMV、PVY等病毒病，烟蚜为害可降低烟叶烟碱含量，减小烟叶面积，严重降低烟叶品质，给烟草生产带来巨大的经济损失[2]。目前烟蚜的防治主要依赖于化学药剂，使用不当易引起污染等问题，且长期使用可造成烟蚜生理发生变异，产生可遗传的抗药性[3-4]。生物防治是一种清洁、绿色的防控技术，烟蚜的生物防治主要通过使用生物农药、释放天敌昆虫等手段[5-6]，如利用瓢虫[7]和蚜茧蜂[8]。

虫霉菌是一类能寄生于害虫虫体，导致虫体感染、发病、死亡的真菌。利用虫霉菌防治害虫是一种绿色、安全的生物防治手段。目前该技术在多种害虫的防治上已得到广泛使用，如白僵菌（Beauveria bassiana）防治甘薯象甲、玉米螟和马尾松毛虫，绿僵菌（Metarhizium）防治金龟子等[9]。而在煙蚜方面，目前有报道的烟蚜生防虫霉菌包括白僵菌、绿僵菌[10-14]、球毛壳菌（Chaetomium globosum）[15-17]、蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）[18]、Lecanicillium longisporum[19-20]、弗氏新接霉蚜霉菌[Neozygites fresenii （Nowakowski）][21]、耳霉菌（Conidiobolus major）[22]和青霉菌（Paecilomyces sp.）[23-26]。但目前尚无一种被广泛应用于烟蚜防控的虫霉菌，限制这一技术发展的主要因素包括烟蚜虫霉菌菌种资源较少、致病力弱且培养难度大，此外虫霉菌对田间环境条件的适应性较差。基于此种情况，本试验从贵州不同烟区采集、分离和筛选对烟蚜具有较强致病力的生防优势虫霉菌，以丰富烟蚜虫霉菌菌种资源，并通过室内培养条件的初筛，为田间适用条件研究奠定基础。以期为烟蚜虫霉菌的研究与开发利用提供科学依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

1.1.1 试验地点 贵州大学农产品质量安全实验室，贵州大学作物保护研究所。

1.1.2 供试材料 供试烟草：毕纳1号，2015—2016年栽培于贵州大学作物保护研究所试验温棚内；供试烟蚜：当年培育于毕纳1号烟叶上的健康烟蚜。

1.2 试验设计

1.2.1 虫霉菌采集与分离 虫霉菌采集：分别从贵州省毕节、遵义、六盘水、安顺和黔西南烟区采集受虫霉菌感染的烟蚜，其特征为已死烟蚜的虫尸上长有菌丝，颜色一般为白色、灰色、黑色和黄色。虫霉菌分离：将受感染的烟蚜粘在含有PDA的培养皿盖内中央，将培养皿置于28 ℃恒温箱内培养7 d，待PDA上长出菌落后，根据颜色和长势不同，将菌株进行纯化培养。

1.2.2 菌悬液制作 将纯化后的菌株挑到PDA平板上置于25 ℃恒温箱内培养7 d，用打孔器取0.5 cm菌饼至含有150 mL不加琼脂的PD液体培养基的三角瓶内，将三角瓶置于25 ℃恒温震荡箱内培养5 d备用。

1.2.3 优势虫霉菌的筛选 挑30头大小相似的健康无翅烟蚜置于15 cm×15 cm的烟叶背面，将烟叶置于培养皿内保湿培养。将菌悬液用纱布过滤掉菌丝后，喷施于烟叶和蚜虫体上，喷至烟叶滴水。每个处理3次重复，并设置CK对照（喷施无菌水）。观察3 d和7 d后烟蚜虫尸是否长出霉菌来判断是否被感染（正常死亡的烟蚜，后期虫尸变黑色干扁，无霉菌）。从感染的虫尸中按照步骤1.2.1进行霉菌分离，确认感染前施用的菌株与感染后分离所得的菌株是否一致。

对具有感染作用的菌株进行感染力测定：在室内盆栽烟苗，待5叶时将30头大小相似的健康无翅烟蚜接到烟叶背部，室温下培育15 d。在将具有感染作用菌株菌悬液用纱布过滤掉菌丝后，喷施于烟叶和蚜虫体上，喷至烟叶滴水。每个处理3次重复，并设置CK对照（喷施无菌水）。调查7 d、11 d和15 d后烟蚜的感染率。

感染率=感染虫口数/虫口总数×100%

1.2.4 虫霉菌的鉴定 采用Biomiga公司的Fungle gDNA Kit提取试剂盒提取DNA，选用ITS4/ITS5引物进行ITS基因片段扩增，PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，并将获得的序列在NCBI中BLAST软件进行同源性比对。

1.2.5 虫霉菌适宜培养基的筛选 用表1中的培养基在28 ℃下对筛选得出的优势虫霉菌进行培养，每种培养基设3次重复，用“十字交叉法”每隔24 h测量虫霉菌菌落直径，并计算菌丝生长速度。

生长速度（cm/h）=菌落直径（cm）/培养时间（h）

1.2.6 虫霉菌适宜温度条件的筛选 用PDA培养基在10、15、20、25、30、35 ℃的恒温培养箱中对虫霉菌进行培养。每种温度条件设3次重复，并每隔24 h测量虫霉菌菌落直径，计算菌丝生长速度。

1.2.7 虫霉菌适宜光照条件的筛选 设置全光照、全黑暗、12 h光照12 h黑暗的光照条件且温度为28 ℃恒温的培养条件，用PDA培养基对虫霉菌进行培养。每种光照条件设3次重复，每隔24 h测量虫霉菌菌落直径，计算菌丝生长速度。

1.2.8 虫霉菌适宜pH条件的筛选 将虫霉菌置于PDA平板上培养7 d，配制pH值分别3、4、5、6、7、8、9、10的PDA液体培养基各150 mL于三角瓶内，将平板上的虫霉菌用打孔器取直径0.5 cm的菌饼（CK为无菌PDA小块），将菌饼分别放入不同pH值的液体培养基中，每个pH处理设3次重复，三角瓶封口后，置于28 ℃恒温和150 r/min的震荡箱中培养5 d。5 d后，将三角瓶内的菌液用纱布进行过滤，后将装有滤渣的纱布置于80 ℃的烘箱内烘干8 h，取出烘干后带有滤渣的纱布进行称量，计算出平均菌株干物质重量。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和Dps 7.05數据统计软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 虫霉菌的采集、分离与筛选

2015—2016年间从贵州省毕节市、遵义市、六盘水市、安顺市和黔西南州烟区共采集得感染烟蚜标本11个，分离获得真菌菌株16株，按照采集顺序标记为CM-1、CM-2、CM-3…CM-16。通过感染作用测定发现（表2），施用菌悬液3 d后仅有CM-4、CM-6、CM-9、CM-11和CM-15具有感染作用，7 d后CM-4、CM-5、CM-6、CM-9、CM-11、CM-14和CM-15等7株菌株对烟蚜具有感染作用，其他菌株均无感染作用。

将具有感染作用的7株菌株进行感染力测定。

结果如表3所示，随施用时间的延长，各菌株处理对烟蚜的感染率不断增大。施用菌悬液7 d后，所 有菌株对烟蚜的感染率均大于15%，其中菌株 CM-11的感染率达到22.62%。11 d后菌株CM-11 的感染率达到56.15%，高于其他菌株处理，菌株 CM-15次之，达52.33%，其次为CM-4为51.34%， 该3株菌株感染率显著高于其他处理。15 d菌株 CM-15、CM-11和CM-4对烟蚜的感染率分别达到 了72.05%、69.80%和68.07%，均显著高于其他菌 株，且同CK相比差异极显著。试验结果表明，菌株CM-4、CM-11和CM-15为感染力较强，是具有较高生防潜力的优势虫霉菌。

2.2 优势虫霉菌的鉴定

虫霉菌CM-4、CM-11和CM-15在PDA平板上的菌落形态分别如图1A、图1B和图1C所示。CM-4

菌丝体呈金黄色，培养基因菌体产生渗出物而变为紫红色，菌落背面呈暗紫色，如图1D所示，其孢子呈舟形、纺锤形或卵形，灰褐色，大小为9～12 μm×

5～6.5 μm；CM-11菌丝紧密，呈乳白色，背面呈米黄色（图1E），经过多种不同条件培养，均未发现该菌株产孢；CM-15菌丝棉絮状，褐色，孢子球形、近球形或卵形（图1F），直径3.5～6 μm，为无色或浅灰色。

将序列测定所获得的序列与GenBank中已有序列进行同源性比较，结果发现，CM-4与金色毛壳菌（Chaetomium aureum）的同源性为100%，CM-11与渐狭蜡蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）同源性为99%，CM-15与少根根霉（ Rhizopus arrhizus）同源性为100%。根据病菌形态学鉴定以及该 DNA序列在NCBI进行同源性对比双重结果，最终确认优势虫霉菌菌株CM-4为金色毛壳菌，CM-11为渐狭蜡蚧菌，CM-15为少根根霉菌或称米根霉菌。

2.3 不同培养基对虫霉菌生长的影响

由图2可以看出，菌株CM-15在各个培养基中的生长速度明显高于菌株CM-4和CM-11。不同虫霉菌在不同培养基中的生长速度均不相同，其中菌株CM-4在培养基A中的生长速度显著高于其他培养基，达到0.032 9 cm/h；菌株CM-11在培养基E中的生长速度0.018 1 cm/h，高于其他培养基处理；菌株CM-15适应力较强，在所有供试培养基中均保持高速生长，其中在培养基E中的生长速度最大，达0.354 2 cm/h。试验表明，在供试的7种培养基中，菌株CM-15的生长力较强，而菌株CM-11较弱。适宜CM-4生长的培养基为培养基A，而适宜CM-11和CM-15生长培养基为培养基E。

2.4 不同温度对虫霉菌生长的影响

不同温度条件下虫霉菌的生长速度如图3所示，菌株CM-4在10 ℃时生长停止，当温度为25 ℃时

生长速度达到最大，达0.018 2 cm/h；菌株CM-11在10～35 ℃条件下均能生长，在温度为25 ℃时生长速度达0.010 6 cm/h，在20 ℃时达0.009 6 cm/h，两者均显著高于其他温度处理；菌株CM-15在10～35 ℃条件下生长速度出现2次峰，第1次出现在15 ℃时，第2次在30 ℃，该菌株在30 ℃条件下生长速度达到最大的0.391 5 cm/h，其次为25 ℃时的0.298 3 cm/h。结果表明，虫霉菌菌株CM-4、CM-11和CM-15适宜培养的温度条件分别为25～30 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃。

2.5 不同光照条件对虫霉菌生长的影响

如表4所示，不同光照条件下虫霉菌的生长具有差异。其中，菌株CM-4和CM-11在12 h光照12 h黑暗下生长速度达到最大分别为0.020 7 cm/h 和0.009 0 cm/h，但菌株CM-4和CM-11在不同光照条件下的生长速度差异不显著，表明CM-4和CM-11的光照条件适应能力较强；菌株CM-15在不同光照条件下的生长速度差异显著，其在全黑暗条件下生长速度最大，达0.281 2 cm/h。由此可见，菌株CM-4和CM-11可适应不同光照条件下培养，而菌株CM-15适宜在全黑暗条件下培养。

2.6 不同pH对虫霉菌生长的影响

如图4所示，菌株CM-4和CM-11在pH值为7时，产生干物质分别达到最大，其次为pH 6时，且二者均显著高于其他pH处理，其中CM-11在pH为3时停止生长。表明pH 6～7是菌株CM-4和CM-11的适宜培养酸碱条件。CM-15在pH 5时干物质达到最大，达0.39 g，其次为6时的0.37 g，均显著高于其他pH条件。综上表明菌株CM-4和CM-11喜好酸碱度为中偏酸的环境条件；CM-15适宜在偏酸条件下培养。

3 讨 论

毛壳菌属（Chaetomium sp.）真菌中，球毛壳菌（Chaetomium globosum）对蚜虫等多种害虫具有防控作用[27]，而金色毛壳菌（Chaetomium aureum）此前多報道用于病害防控，其与辣椒疫霉病、灰霉病和黄瓜灰霉病有拮抗作用[28-30]，而用于烟蚜防治尚无相关报道；KIM等[31]曾从蚜虫虫体中分离获得渐狭蜡蚧菌（Lecdanicillium attenuatum），并发现其对烟蚜、棉蚜等具有寄生致死作用，本试验结果进一步验证该菌株的致病力，此外，渐狭蜡蚧菌还可用于防控柑橘粉虱[32]、茶小绿叶蝉[33]和南方根结线虫[34]；少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）作为医学病原菌，可引起人体多种皮肤病[35]，因此其安全性尚需进一步探究。

关于虫霉菌对蚜虫的致死机理，臧建成[36]认为暗孢耳霉（C.obscurus）通过菌丝侵入蚜虫体内，利用寄主体内营养进行生长繁殖所致；李武高[21]等报道弗氏新接霉通过体壁穿透和机械压力的方式杀死蚜虫；GURULINGAPPA等[37]发现蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）菌丝体能产生对棉蚜具有毒力作用的乙酸乙酯和甲醇等毒素。GLISZCZYNSK等[38]认为将生防菌基因进行转化可增强其致病力。本试验尚未对筛选出的3株致病霉菌进行相关致病因子探索。

生防虫霉菌使用技术的另一难点在于菌株的田间条件适应性能，一般自然条件适应力较强的菌株更具有开发利用前景[39-40]。除菌株天然的适应力外，还可通过人工驯化、基因转化[38]或定殖于植物中[41]等措施来提高菌株适应力，本试验对所获得的3株虫霉菌进行培养条件初筛，可为菌株适应力及田间施用条件研究奠定基础，但要确定培养基、温度、光照、pH等条件的互作关系，明确适宜的培养条件，仍需要做进一步的互作试验探究。

4 结 论

试验筛选获得了金色毛壳菌（Chaetomium aureum）、渐狭蜡蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌 （Rhizopus arrhizus） 3株对烟蚜具有较强致病力的生防虫霉菌株，其中金色毛壳菌和少根根霉对烟蚜的感染作用属首次报道，丰富了烟蚜生防菌资源。

通过初步筛选分别获得了适宜3株菌株生长的温度、pH和光照条件，为该菌株培养保存和田间施用技术研究奠定基础。

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