张恒 朱迪 何现梅 彭丽娟

摘 要：为了解贵州安龙烤烟苗期枯萎病原菌种类，筛选防治该病害化学药剂，采用组织分离法对贵州安龙烟苗枯萎病发病组织进行病原分离，结合形态特征、rDNA-ITS序列比对鉴定病原菌，并进行致病性测定。选用6种药剂，采用生长速率法测定供试药剂对病原菌菌丝抑制率。结果表明，芬芳镰孢（Fusarium redolens）为引起烤烟枯萎病的病原菌；室内毒力測定表明，40%氟硅唑EC、42.4%唑醚?氟酰胺SC对烤烟枯萎病菌菌丝生长有较好的抑制作用。

关键词：烤烟；芬芳镰孢；病原鉴定；杀菌剂

中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119（2018）06-0036-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.006

烟草作为我国重要的经济作物之一，对增加国家财政税收、促进国民经济发展具有重要意义[1-2]。育苗是烤烟生产的首要环节，是获得优质、适产、高效、低成本烟叶的先决条件[3]。目前，漂浮育苗是我国最主要的育苗方式[4]，培育得到的烟苗具有根系发达、苗株健壮、烟苗整齐度高等优点，有利于集约化统一管理和实现育苗工场化，烟苗素质标准化，栽培管理专业化[5-6]。蒋世君[7]研究发现河南省烤烟苗期发生烟草灰斑病，罗正友等[8]在贵州省金沙县和安顺市西秀区烟草漂浮苗上也发现了烟草灰斑病（Alternaria pluriseptata）。汪汉成等[9]在贵州省烟草科学研究院烤烟漂浮育苗大棚中发现由九州镰孢菌（Fusarium kyushuense）引起的烟草茎部腐烂病。因此，随着漂浮育苗技术的广泛应用，烟草苗期病害发生有逐渐加重趋势。烤烟苗期病害的诊断与防治，对培育无病壮苗，生产优质烟叶具有重要意义。2016年在贵州安龙部分烤烟育苗小棚中发生了苗期枯萎病，采集苗期枯萎病标本，经实验室分离、纯化和鉴定，并进行室内药剂毒力测定。以期为烤烟苗期枯萎病害的诊断、防治提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烤烟苗期枯萎病病害标本于2016年4月22日在贵州安龙栖凤街道吴家庄育苗小棚采集，品种为云烟87。致病性测定烟苗由贵州大学农学院植物病理实验室培育，品种为云烟87。

1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂凝胶（PDA）培养基[10]：用于烤烟苗期枯萎病菌分离、菌落外观形态观察、室内药剂筛选。马铃薯葡萄糖（PD）培养基[10]：用于烤烟苗期枯萎病菌接种用孢子悬浮液制备。康乃馨叶片（CLA）培养基[11]：用于烤烟枯萎病菌显微形态观察。

1.3 病原菌分离鉴定

1.3.1 病原菌分离 取发病烟苗根、茎部，采用组织分离法分离，纯化后菌株保存于PDA斜面培养基上和无菌水中，于4 ℃冰箱保存备用[10]。

1.3.2 致病性测定 采用孢子悬浮液蘸根法、根部刺伤法、土壤接种法等[10]3种方法将病原菌接种到健壮无病的云烟87烟苗上。用血球计数板将分生

孢子数调节到1×104个/mL，孢子悬浮液现配现用[12]。每种方法接种5株烟苗，4次重复，以无菌水为对照，7 d后观察烟苗发病情况。对接种发病烟苗根、茎部进行组织分离，纯化培养的菌株与1.3.1所述菌株同时进行鉴定。

1.3.3 病原菌形态 将菌株接种于PDA、CLA平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养，观察菌落在PDA平板上外观形态；5 d后从CLA平板上挑取少许菌丝制片镜检，观察大型分生孢子、小型分生孢子、产孢细胞、厚垣孢子等，测量大型、小型分生孢子大小（n=50）。参考文献[13]的分类系统，对分离的病原菌进行形态鉴定。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列 用灭菌手术刀刮取足量病原菌丝，使用微量基因组DNA试剂盒（型号：D3096，厂家：Omega Bio-Tek公司）提取病原菌DNA，PCR反应体系与扩增程序参见文献[14]。

PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果经Blast后与NCBI数据库中已知序列进行同源性比较。依据致病性测定结果、病原菌形态特征，结合同源性比较结果，鉴定烤烟苗期枯萎病菌种类。

1.4 室内药剂毒力测定

1.4.1 供试药剂 6种供试药剂种类及生产厂家见表1。

1.4.2 毒力测定 采用生长速率法测定供试药剂对烤烟枯萎病菌菌丝生长的抑菌活性[10]。采用含毒介质法，将6种药剂稀释不同倍数后，配制不同浓度的PDA含药培养基平板[15]。培养6 d后，十字交叉划线法测量菌落直径，测量结果取平均值，计算供试药剂的相对生长抑菌率[16]。

抑菌率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100

根据各药剂生长抑制率和浓度值建立毒力方程y=a +bx，得各药剂的EC50值及相关系数r。数据处理分析软件为农药室内生物测定数据处理系统（武汉市蔬菜科学研究所﹑农业部农药检定所）[17]。

2 结 果

2.1 危害症状

烟苗染病后，初期表现为叶片轻微褪绿，植株矮小，长势不好；根部受害明显，主根和须根腐烂发黑；发病严重时叶片发黄至发白失绿，甚至死亡（图1）。

2.2 病原菌致病性测定

接种7 d后观察，孢子悬浮液蘸根接种（图2a）、土壤接种（图2b）和根茎部刺伤接种（图2c）均使烟苗发病。染病后，初期表现为叶片萎蔫发黄，根部受害明显，主根和须根短小，根量少，腐烂发黑（图3a）。

从回接烟苗病株组织再次分离病原物，结合形态学特征与ITS序列，两次分离的培养物一致，符合柯赫氏法则，证明该菌株为烤烟苗期枯萎病菌。

2.3 病原菌形态特征

CLA培养基上，菌丝蛛网状，菌落白色，无色素。由图4看出，PDA培养基上，菌落初为白色，后逐渐转为青莲色，菌落平滑，具一圈轮纹，菌丝羊毛状，生长初期菌丝生长较快，呈放射状，28 ℃培养4 d后，菌落直径为4.2 ～ 4.6 cm。大型分生孢子为马特型，分隔较不明显，多为1 ～ 3 隔，基胞、顶胞稍显钝圆，量度为 31.2～42.2 μm×3.7～6.3 μm。小型分生孢子数目较多，多为卵形或肾形，分隔不明显，多为0～1隔，量度为6.2 ～14.34 μm×2.30～4.13 μm。产孢细胞为单瓶产孢梗，未观察到厚垣孢子。根据以上形态特征，初步鉴定为芬芳镰刀菌（Fusarium redolens）。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列比对

病原菌rDNA-ITS序列与NCBI数据库中的已知序列比对，结果显示，与芬芳镰刀菌（F. redolens）同源性为100%。

2.5 室内毒力测定

表2结果表明，6种药剂对烤烟枯萎病菌菌丝生长均有不同程度抑制作用，药剂浓度与菌丝生長抑制程度成正相关。6种药剂对烤烟枯萎病菌的毒力从大到小依次为40%氟硅唑EC > 42.4 %唑醚?氟酰胺SC > 40 %百菌清SC > 70% 丙森锌WP > 64 %噁霜灵锰锌WP > 2 %春雷霉素SL。其中40 %氟硅唑EC抑菌效果最好，EC50值为0.64 mg/L；其次是42.4 %唑醚?氟酰胺SC，EC50值为4.94 mg/L；抑菌效果最差的是2 %春雷霉素SL，EC50值为1 025.86 mg/L。6种药剂对烤烟枯萎病菌菌丝抑制作用见图5～10。

3 讨 论

由镰孢属（Fusarium）真菌引起的植物枯萎病，世界范围内广泛分布，寄主包括经济作物、茄科作物、瓜类作物、花卉植物等[18]。枯萎病菌为土壤习居菌，主要以菌丝体、厚垣孢子在土壤及未腐熟绿肥中越冬，主要靠病苗、病土和流水传播[19]。汪汉成等[20]对贵州主栽的4个烤烟品种裸种进行带菌检测，4个烤烟品种裸种上均携带病原真菌，优势菌群主要为链格孢属（Alternaria）、芽枝孢菌属（Cladosporium）、镰孢菌属（Fusarium）和赤霉菌属（Gibberella）等4个属的真菌。由此推断，安龙烟苗发生枯萎病的原因一种可能是育苗基质或育苗盘未彻底消毒，其中可能含有引致安龙烤烟苗期枯萎病的镰孢属真菌；另一种可能是烤烟种子带菌。虽然烤烟包衣剂内含有杀菌剂，但添加的杀菌剂有可能对镰孢属真菌无抑制作用。对烤烟苗期土壤或种子传播的病害，选用无病种子和育苗基质，做好育苗大棚和育苗盘的消毒，可一定程度降低该类病害发生几率。

汪汉成等[9]在贵阳发现的引起烤烟苗期茎部腐烂病的病原菌为九州镰孢（F. kyushuense）。本文从发病烟苗上分离致病菌，结合rDNA-ITS序列比对与形态特征，鉴定安龙烤烟苗期枯萎病的病原菌为芬芳镰孢（F. redolens）。2种苗期病害从症状上看，九州镰孢主要引起烟苗腐烂，芬芳镰孢主要引起烟苗枯萎。

目前，利用化学药剂防治作物枯萎病仍是较为有效的方法之一，我国生产上用于防治作物枯萎病较好的药剂主要有唑类、甲酯类、酰胺类等[21]。本文通过室内毒力测定发现，40%氟硅唑EC对烤烟苗期枯萎病菌抑制效果最好，其次为42.4%唑醚·氟酰胺SC。因此40%氟硅唑EC和42.4%唑醚·氟酰胺SC可做为防治烤烟苗期枯萎病的药剂，防治效果需进一步结合田间试验确定。

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