李盼盼 李方明 申国明 高林 余军 郑璇 张鹏

摘要：为研究环境生态因素对烟草内生真菌的影响，在湖北省恩施州选取不同有机质含量和酸碱度的田块，以云烟87为供试植株，探究土壤有机质含量和酸碱度对烟草内生真菌生物多样性的影响。试验分别选取6块不同有机质含量（分别为16.3，20.7，233，27.1，31.4和35.6 g/kg及4块不同pH（分别为4.3，5.5，6.4和7.6）的田块，采用五点取样法采集健康烟草植株，分离纯化根中内生真菌并根据rDNA-ITS序列分析进行菌种鉴定，以Shannon多样性指数及相对分离频率反映内生真菌生物多样性。结果发现，烟草内生真菌生物多样性随土壤有机质含量的升高呈先上升后下降的趋势，在6个不同土壤有机质含量下，内生真菌shannon多样性指数分别为0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59：而烟草内生真菌生物多样性随土壤pH的升高呈下降的趋势，在4个不同土壤pH下，内生真菌Shannon多样性指数分别为1.36、1.12、0.93和0.83。研究表明，土壤有机质含量和酸碱度会对烟草内生真菌生物多样性产生一定影响。在一定范围内，土壤有机质含量的升高或者pH的降低可以增加烟草内生真菌的物种丰富度。

关键词：土壤；有机质：酸碱度：烟草内生真菌；生物多样性

烟草内生真菌（Tobacco endophytic fungi）是定殖于烟草组织内部，不会引起烟草产生明显病害或者不良影响的一类真菌。烟草内生真菌具有丰富的生物多样性，其在与宿主植物烟草的协同进化过程中建立了互利共生关系，对烟草的生长、固氮、抗病害等发挥着重要作用。植物内生真菌的来源途径之一是根际微生物通过植物侧根的裂缝进入植物体内。土壤是根生长发育的必要环境，而其理化性质特别是有机质含量和酸碱度对根际土壤中微生物的生物活性及多样性有重要影响。焦晓光等发现土壤有机质含量最高的农田黑土微生物群落的丰度、多样性和均匀性指数最高。在外界环境一致的条件下，农田黑土有机质含量不同可影响土壤微生物群落的代谢能力。米亮通过对4个不同有机质含量的黑土微生物群落结构和代谢功能多样性进行比较，从而解析了有机质含量对黑土微生物群落结构和代谢功能及作物根际微生物群落结构的影响。孙冰洁等综述了农田土壤物理性质（密度、孔隙、水分、温度）及化学性质（土壤pH、土壤有机质）对土壤微生物群落的影响。由上推测，土壤的理化性质及生态环境因子会通过影响烟草根际土壤微生物从而对烟草内生真菌的多样性及分布产生一定影响，但目前还没有关于土壤有机质含量和酸碱度对烟草内生真菌生物多样性影响的相关报道。

生物多样性的研究对于认识生物群体的结构及功能、行为和生活史，以及他们与人类生存环境的关系，科学有效地开发利用生物资源具有十分重要的意义。烟草内生真菌是烟田微生物生态系统重要的一个类群，开展烟草内生真菌种群多样性的研究不仅可以在群体水平上揭示其空间、地理区域分布的动态变化规律，构建烟草内生真菌研究的基础理论与基本方法，也为以后更深入的研究与资源开发利用奠定基础。

恩施州位于湖北省西南部，气候、土壤条件优良，烟草种植历史悠久。研究表明，恩施州土壤养分含量分布极不均衡，各植烟点间的养分含量差异较大：土壤有机质的范围为2.8-43.8 g/kg，土壤pH值范围为4.1-7.9。本研究利用湖北恩施土壤有机质含量、酸碱度范围广的特点，探究土壤有机质含量和酸碱度对烟草内生真菌生物多样性影响，以期找到土壤有机质含量、酸碱度和烟草内生真菌多样性之间的关系，为系统构建土壤理化性质一烟草内生真菌多样性研究体系奠定基础。

1材料与方法

1.1试验田块选择及样品采集

在参考已有试验研究的基础上，于湖北恩施州望城坡和城郊烟站，测定并选择6块土壤有机质含量分别为16.3，20.7，23.3，27.1，31.4和35.6g/kg，但其他理化性质差异不显著的田块：选择4块土壤pH分别为4.3，5.5，6.4和7.6，但其他理化性質差异不显著的田块进行烟株根系样品的采集。于2017年5-8月，采用五点取样法采集健康烟株的根部（主根，地下约5cm处），然后带回实验室4℃保存，并在24h内处理完毕。

1.2烟草内生真菌的分离

将采集的根部样品在自来水下充分冲洗，除去表面的泥土。表面灭菌采取如下步骤：75%乙醇消毒1 min：2.5%次氯酸钠消毒30 s：75%乙醇消毒1min：然后用无菌水漂洗3遍。将灭菌的根部组织切块，将切口插入PDA培养基上，28℃培养3～7d。待培养基中切口处有菌丝长出，挑取菌丝至新的PDA培养基上，划线稀释分离，直至获得纯培养。试验设置未经表面灭菌的组织作为对照，并通过漂洗液检验法和组织印迹法来检验表面灭菌效果。

1.3内生真菌的分类鉴定

采用CTAB法提取分离的内生真菌基因组DNA。利用通用引物ITSl和ITS4进行PCR扩增。扩增成功的PCR产物纯化后经上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。通过BLAST序列比对，最终确定菌株的分类地位。

1.4数据分析

以香农多样性指数（shannon's diversity index，H）来反映烟草内生真菌的生物多样性，用相对分离频率衡量某种内生真菌的优势度，用Sorenson相似性系数Cs来分析烟草内生真菌菌群组成的相似程度。其公式分别为：

其中，K为烟草内生真菌种类的总数，P为某种烟草内生真菌的菌株数占全部内生真菌菌株数的百分数。

相对分离频率（%）=某种内生真菌的菌株数/全部内生真菌总菌株数

（2）

其中，相对分离频率（RF）≥10%的内生真菌为优势菌，RF≥1%的内生真菌为常见菌，RF<1%的为稀有菌。

其中，为两个土壤有机质含量或pH值下烟草样品中共有的内生真菌属数，a为某一土壤有机质含量或pH值下烟草样品中内生真菌属数，b为另一土壤酸碱度或pH下烟草样品中内生真菌属数。

2结果

2.1不同土壤有机质含量下烟草内生真菌的多样性

在6个土壤有机质含量下采集的健康烟株根系中共分离到278株内生真菌（表1），鉴定为34属，Shannon多样性指数为4.56。6个有机质含量下分别分离到15、19、22、28、23和18属，Shannon多样性指数分别为0.53、0.67、0.82、1.09、0.86和0.59。根据菌株的相对分离频率，优势菌群为曲霉属Aspergillus，其相对分离频率为1 8.35%。常见菌群为23属，分别为刺盘孢属Colletotrichum、茎点霉属Phoma、链格孢属Alternaria、青霉属Penicillium、弯孢属Curvularia、附球菌属Epicoccum、镰孢属Fusarium、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis、踝节菌属Talaromyces、黑孢属Nigrospora、蔓枯病属、球座菌属Guignardia、木霉属、毛壳属、小丛壳属、白粉寄生孢、毛霉属、棒孢属、端梗孢属Acrophialophora、新萨托属Neosartorya、叶点霉属Phyllosticta、梭孢壳属Thielavia和枝孢属Cladosporium。稀有菌群为10属，分别为派伦霉属Peyronellaea、角担菌属Ceratobasidium、松球壳孢菌、双极霉属Bipolaris、耐碱酵母属Galactomyces、炭角菌属Xylariaceae、拟青霉属Paecilomyces、并头状菌属Syncephalastrum、旋孢腔属CochBobolus、被孢霉属Mortierella。其中，耐碱酵母属和并头状菌属只在有机质含量为27.1 g/kg的根系中分离到，旋孢腔属和被孢霉属只在有机质含量为31.4g/kg的根系中分离到，派伦霉属、松球壳孢菌、炭角菌属、角担菌属分别只在有机质含量为16.3、20.7、23.3、35.6 g/kg的根系中分离到。由此可见，烟草内生真菌的多样性随着土壤有机质含量的升高呈现先上升后下降的趋势，并且部分菌株只在特定的土壤有机质含量下被分离到，表现出专化性。

2.2不同土壤酸碱度下烟草内生真菌的多样性

在4个土壤pH值下采集的健康烟株根系中共分离到内生真菌215株，鉴定为32属，Shannon多样性指数为4.23。土壤pH值4.4、5.5、6.4、7.6下分别分离到29、25、22和18属，Shannon多样性指数分别为1.36、1.12、0.93和0.83。根据菌株的相对分离频率，曲霉属Aspergillus为优势菌群，其相对分离频率为16.74%。常见菌群为20属，分别为刺盘孢属Colletotrichum、茎点霉属Phoma、链格孢属Alternaria、青霉属Penicillium、弯孢属Curvularia、附球菌属Epicoccum、镰孢属Fusarium、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis、踝节菌属Talaromyces、黑孢属Nigrospora、蔓枯病属Didymella、球座菌属Guignardia、木霉属Trichoderma、小丛壳属Glomerella、双极霉属Bipolaris、毛霉属Rhizomucor.拟青霉属Paecilomyces、新萨托属Neosartorya、叶点霉属Phyllosticta、梭孢壳属Thielavia。稀有菌群为11属，分别为毛壳属Chaetomium、派伦霉属Peyronellaea、小光壳属Leptosphaerulina、半内果菌属Hamigera、白粉寄生孢Ampelomyces、松球壳孢菌、棒孢属Corynespora、端梗孢属Acrophialophora、Setophoma（尚未中文命名）、并头状菌属、枝孢属Cladosporium（图1）。其中，半内果菌属、Setophoma只在土壤pH为4.4的烟株根系中分离到，端梗孢属、枝孢属、派伦霉属分别只在土壤pH为5.5、6.4、7.6的烟株根系中分离到。由此可见，烟草内生真菌的多样性随着土壤pH值的升高呈现下降的趋势，并且部分菌株同样表现出专化性。

2.3不同土壤有机质含量和酸碱度下烟草内生真菌菌群组成的相似性

由表2可见，不同土壤有机质含量下烟草内生真菌组成的相似性系数介于0.61～0.84，含量16.3g/kg的菌群组成与35.6 eCkg的菌群组成相似性系数最低，为0.61：而有机质含量为23.3 g/kg的菌群组成与27.1 g&g的相似性系数最高，为0.84。不同土壤pH下（表3）烟草内生真菌组成的相似性系数介于0.70～0.89，土壤pH5.5和6.4时的菌群组成与7.6时的菌群组成相似性系数均为0.70，而土壤pH 4.4时的菌群组成与5.5时的菌群组成相似性系数最高，为0.89。总体而言，不同有机质含量和酸碱度下烟草内生真菌的菌群组成相似性较高。

3讨论

本研究选择6个不同有机质含量和4个不同酸碱度的田块采集健康烟株的根系组织，进行内生真菌的分离、纯化和鉴定。Shannon多樣性指数表明，烟草内生真菌的多样性随着土壤有机质含量的升高呈现先上升后下降的趋势，而随着土壤pH的升高呈现下降的趋势。植物内生真菌的来源途径之一是根际微生物，土壤环境会对根际真菌的定殖产生重要影响，因此土壤环境也会对根中的内生真菌产生一定的间接影响。周奇研究发现，根际真菌丰富度和多样性指数均与土壤有机质含量呈显著正相关。随着土壤有机质含量的升高，根际真菌的菌群多样性逐步增加。但在本试验选取的土壤有机质含量范围内，烟草内生真菌的物种多样性没有随着土壤有机质含量的上升呈现上升的趋势，而是呈先上升后下降的趋势，原因可能是适宜烟株生长的土壤有机质含量为20 g/kg左右，有机质含量过高违背烟草的需肥规律，不利于烟株的生长发育。当土壤有机质含量超过30 g/kg，烟株根系生长发育不良，不利于根际微生物的进入。研究显示，土壤pH可以改变土壤微生物群落的结构，真菌数量与土壤pH呈负相关性。本试验中，随着土壤pH的升高，烟草内生真菌的多样性呈现下降的趋势。由此可见，土壤碱度升高会降低烟草内生真菌的多样性。

在土壤不同的有机质含量和酸碱度下，烟草内生真菌的优势菌群均为曲霉属Aspergillus，可能是由于土壤中曲霉属真菌受土壤有机质含量和酸碱度变化的影响较小，且在所有根际真菌中处于主导地位：也可能是与其他根际真菌相比，曲霉属真菌对烟草根系的侵染能力较强。并且，本试验发现烟草内生真菌表现出土壤理化性质专化性，即在某一特定的土壤有机质含量和酸碱度下，均有特定属出现。已有研究发现，烟草内生真菌具有组织专化性，可能是由根、茎、叶的生态位不同造成的。内生真菌的土壤理化性质专化性，可能是因为有机质含量和酸碱度的变化导致根际真菌的群落结构发生变化，某些真菌只有在特定的土壤有机质含量和酸碱度条件下才能生存和侵染根系。

4结论

在6个土壤有机质含量下共分离到278株内生真菌，鉴定为34属。6个有机质含量分别分离到15、19、22、28、23和18属，Shannon多样性指数分别为0.53、0.67、0.82、1.09、0.86、0.59。内生真菌多样性随着土壤有机质含量的升高呈先上升后下降的趋势。在4个土壤pH值下共分离到内生真菌215株，鉴定为32属。土壤pH为4.4、5.5、6.4、7.6下分别分离到29、25、22和18属，Shannon多样性指数分别为1.36、1.12、0.93、0.83。内生真菌多样性随着土壤pH的升高呈现下降的趋势。烟草内生真菌表现出土壤理化性质专化性。以上研究表明，烟草内生真菌的多样性在一定程度上受环境生态因素的影响，而其他环境生态因素，如海拔高度、气候条件等对烟草内生真菌多样性的影响同样值得进一步探究。