常爱霞 屈亚芳 王国平 李洋洋 罗成刚 冯全福 陈志强 付宪奎 杨爱国 胡日生 向世鹏 王元英

摘要：为探索大白筋599特征香气性状的关键致香物质基础和分子机制，为特香型烤烟品种培育及工业利用奠定基础，通过不同品种（系）的表面分泌物检测及烟叶感官鉴定比较，明确大白筋599特征香气性状关键致香物质基础：通过对不同品种中调控关键致香物质合成的基因进行测序，明确大白筋599特征香气性状形成的分子基础。结果表明，烤烟品种大白筋599和香料烟品种Samsun表面分泌物中含有赖百当二萜冷杉醇，而普通烤烟G28等均不含冷杉醇。普通烤烟G28与大白筋599杂交或回交的后代品系中，含有冷杉醇的均具有大白筋599特异香气特性，不含冷杉醇的没有特异香气特性。调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2的第292位碱基在不同品种间具有多态性，在大白筋599中是野生型碱基G，而在供试普通烤烟及生产主栽品种中是突变型碱基T。冷杉醇是烤烟品种大白筋599特异香气性状形成的关键致香物质。调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2的第292位碱基在大白筋599及供试普通烤烟品种和主栽品种间的SNP多态性，是导致其香气特征差异的主要原因。通过遗传改良，丰富烟草表面分泌物中致香成分的种类和含量，是培育特色香气风格烤烟品种的重要途径。

关键词：大白筋599；特异香型烤烟：基因NtCPS2：冷杉醇

香气质、香气量和香型风格等香气性状是衡量烟叶和卷烟质量的重要指标。随着中式烤烟型卷烟的不断发展及国际上对卷烟外源香精香料使用的限制，卷烟工业越来越需求香气风格突出、类型多样的高香优质烟叶原料。品种作为影响烟叶质量和香气风格特色的内因，筛选和培育香气品质优良的多类型特色烤烟品种是满足卷烟工业原料需求的最经济有效的途径。特香型烤烟品种大白筋599是我国上世纪60年代选育的农艺性状具有烤烟特征特性，烟叶香气特点具有类香料烟（samsun）特征特性的烤烟品种。该品种原烟香气质好，香气量足，浓度高，飘逸感强，在卷烟工业和烟草品质育种上都具有较高的开发利用价值，但因该品种难以烘烤和感黑胫病等不利特性，以及其关键致香物质基础及分子机制尚不明确等原因，限制了其在工业和育种上的利用。因此，系统分析大白筋599特异香气性状的遗传及致香物质基础，把该品种香气性状定向转移到易烤抗病的优良烤烟品种中，是加快其香气性状利用的重要途径。刘洪祥等曾利用嫁接的方式证明，大白筋599特异香味的有无受接穗品种支配，主要在烟株地上部分的叶片中形成，与砧木品种无关：相关研究对其特殊香气性状的遗传分析表明，其特殊香气质主要受单显性基因控制，特殊香气量可能受微效多基因调控，烤后烟叶在挥发性致香物质的种类和含量上，大白筋599等特香型烤烟与香料烟存在着较大的差异，与烤烟差异相对较小：任民等研究表明，大白筋599等特香型烤烟致香物质含量特点与香料烟更接近，与烤烟差异较大：也有人对大白筋599与其他烤烟品种（系）表面分泌物总量进行了分析，但未明确不同品种间表面分泌物的成分差异。目前，导致大白筋599与其他烤烟香气特性不同的关键致香物质及分子基础仍未知。因不同类型品种烤后烟叶致香物质种类差异较小，而含量差异又受样品采收、调制、等级等多种因素的影响，使得结果复杂多样而难以确定。但烤烟大白筋599在田间即可散发特殊香气（該品种也是通过田间闻香选育而成），所以推测其特殊香气可能是表面分泌物中某种特殊挥发性成分或者某种致香前体物降解产生的挥发性成分所致。本研究拟利用特香型烤烟大白筋599、普通烤烟、香料烟、以及大白筋599与普通烤烟杂交选育的高代杂交和回交新品系材料，从鲜烟叶表面分泌物入手，探索大白筋599特异香气性状的关键致香物质基础和分子机制，为烤烟特异香气性状的育种及工业利用奠定研究基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试品种（系）为烤烟品种G28和大白筋599，香料烟品种Samsun和Basma，以及稳定品系C01（大白筋599与G28回交BC3F5代）、C02（大白筋599与G28回交BC3F5代）和C03（大白筋599与G28杂交F6代）。其中定型品种由国家农作物种质资源平台烟草种质资源子平台提供，回交及杂交后代品系为课题组定向改良品系。

1.2试验设计

试验材料于2016年5月种植于中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地，土壤类型为棕壤，碱解氮含量51.55 mg/kg，有效磷21.60 mg/kg，速效钾131.74 mg/kg，氯离子12.40 mg/kg，有机质0.81%，pH值5.84。试验采取小区试验（小区长12.5 m，行距1m，株距0.5m），每个品种（系）种植2行区。在旺长后期（现蕾前）取样进行表面分泌物检测分析。留取烤后烟叶C3F样品进行后续感官鉴定。

1.3取样和样品前处理

每个品种选取9株长势正常一致的烟株，每3株作为一个重复，共设3次重复。每一重复取样均从单株由顶端向下数4-6叶位（长度15-20cm）各取一片烟叶，每片烟叶在靠近叶基、叶中和叶尖处用直径16mm的打孔器各打一叶盘放入20mL提取小瓶。GC-MS检测前的处理过程参照文献进行。

1.4主要测定物质

烟草表面分泌物主要包括3类成分，二萜（主要包括赖百当二萜和西柏烷二萜）、糖酯和蜡质，其中最丰富的前两大类成分，二萜和糖酯，与烟草香气品质密切相关，也是本研究检测分析的主要物质。烟草中赖百当二萜主要是顺一冷杉醇，该物质用标准品定性：西柏烷二萜参照行业标准《烟草及烟草制品西柏烷二萜醇测定》定性：糖酯用特征离子定性，参照蔡莉莉，SEVERSON等研究结果。各物质利用内标正十七烷进行相对定量。相对定量的公式为：

物质含量（ug/c㎡）=（目标物的峰面积/内标正十七烷峰面积）xN内标/S叶片总面积

1.5GC-MS检测方法

色谱柱：TR-1MS（30.0mx0.25 gmx0.25 um）：进样口温度：265℃：柱头压：100 kPa：传输线温度：280℃：升温程序：从165℃起，以4℃/min升至280℃，保持20 min：进样量：1.0μL：分流比：15.0。GCMS-QP 2010 plus，离子源温度：280.00℃：接口温度：280.00℃：扫描速度：1666。检索谱库：NIST8S。

1.6感官鉴定方法

取烤后C3F等级烟叶制备卷烟样品，由中国农业科学院烟草研究所评吸委员会专家针对特异香气性状表现进行感官定性鉴定。

1.7基因克隆测序方法

以供试品种的DNA为模板，利用oligo7軟件在冷杉醇第3和第4的外显子上设计测序引物，引物（命名为CX FCX R）序列为：上游引物CX F（GATCACTCAAAAAACTCCGAA），下游引物CX R：（TTGTTTCTCTTATGAAGGCAC）。

2结果

2.1冷杉醇特征色谱峰的确定

如图1所示，由空白硅烷化试剂（图1a）及冷杉醇标准品硅烷化后的色谱图（图1b）对比可得，冷杉醇的色谱峰位于15～16min，峰型不规则，非单峰曲线，原因可能是冷杉醇较易分解所致。

2.2不同品种鲜烟叶表面分泌物检测

利用GC-MS对普通烤烟品种G28（不具有特殊香气特性）、香料烟Samsun.香料烟Basma和大白筋599等4个品种进行了鲜烟叶表面分泌物的检测（图2）。主要表面改香前体物定性分析显示，4个品种在西柏烷二萜（主要是a-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇）的成分类型上没有明显差异，差异主要存在于赖百当二萜和糖酯。从赖百当二萜分析，大白筋599和香料烟Samsun含有赖百当二萜冷杉醇，而普通烤烟G28和香料烟Basma不含冷杉醇：糖酯分析显示，大白筋599和G28只含有I-II型糖酯类型：香料烟Samsun和香料烟Basma除含有I-II型糖酯类型外，还含有III-V型糖酯类型（含有3一甲基戊酰基），并且香料烟Basma的III-V型糖酯含量远高于香料烟Samsun。由于大白筋599在田间具有类似香料烟Samsun（普通烤烟没有）的特殊香气，根据以上不同品种表面分泌物种类和含量差异情况，赖百当二萜冷杉醇在大白筋599和香料烟Samsun中都含有，而在普通烤烟中没有，这可能是大白筋599特殊香气特性的主要致香物质基础。2.3大白筋599与普通烤烟杂种后代稳定品系表面分泌物检测及感官鉴定

为了进一步确定赖百当二萜冷杉醇是引起大白筋599特异香气性状的关键物质，分别选择了G28和大白筋599的高代回交导入系C01和C02（G28为轮回亲本），以及其杂交后代品系C03，进行了鲜烟叶表面分泌物的GC-MS检测和烤后烟叶感官鉴定。3个品系GC-MS检测结果如图3，感官评吸结果及冷杉醇含量见表1。

由GC-MS检测结果可见，C01和C03两个品系均含有冷杉醇，并且C01冷杉醇的含量比大白筋599高53%，C03品系冷杉醇含量与大白筋599基本相当：C02中不含冷杉醇，从感官鉴定结果看，C01和C03感官上都具有大白筋599特异香气性状，C01特异香气性状表现比大白筋599更明显，C03特异香气性状表现与大白筋599基本相当，C02没有特异香气性状。可见，特异香气性状的浓郁表现与冷杉醇的有无及其含量的高低明显相关。此外，C01和C02是G28与大白筋599杂交后以G28为回交亲本连续回交的高代回交导入系（BC3F5），两个近等基因系在冷杉醇含量有无的差异，说明大白筋599中调控冷杉醇合成的关键基因区段被成功导入C01中，但没有成功导入C02中。此外，以大白筋599和普通烤烟为亲本杂交培育的多个特香型新品系烤后烟叶致香成分检测结果也表明，具有特异高香气性状的烤烟新品系，均含有冷杉醇。以上结果进一步证明冷杉醇是导致大白筋599具有特异香气性状的关键致香物质。

2.4大白筋599特异香气性状形成的分子基础

2012年，SALLAUD等揭示了赖百当二萜冷杉醇合成的分子机制，其主要受NtCPS2（II类萜烯合酶基因）和NtABS（类贝壳杉烯合酶基因）两个腺毛特异表达基因调控合成。根据国外对150多个烟草种质材料的研究结果，不含冷杉醇的品种，主要是NtCPS2基因发生序列变异所致。这些烟草品种中，NtCPS2基因在开放阅读框的第275位碱基处存在8碱基插入序列（Indel）或在第292位碱基存在SNP突变（由G转变为T），这两种变异均在第4个外显子上且在同一品种中不共存，并且90%以上的不含冷杉醇的品种中，NtCPS2基因发生了SNP突变。

为了进一步明确调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2在大白筋599和普通烤烟（无特异香气性状）间是否有差异，对具有特异香气性状的大白筋599、没有特异香气性状的普通烤烟G28、红花大金元（简称红大）、K326、中烟100等烟草品种的NtCPS2基因的第4个外显子进行了测序，结果表明（图4，第4外显子部分序列），大白筋599的NtCPS2基因第4个外显子是正常序列，而G28、红大、K326、中烟100等品种中NtCPS2基因均在292位碱基处发生了SNP突变。进一步检测红大、K326、中烟100等烤烟品种的鲜烟叶表面分泌物，结果显示3个品种也不含冷杉醇（色谱图略）。可见，大白筋599与普通烤烟品种中NtCPS2基因292位碱基的多态性，使该基因在不同品种中表达的蛋白活性不同，直接影响冷杉醇能否合成。

3讨论

本研究通过对特异香型烤烟大白筋599、普通烤烟、香料烟以及大白筋599与普通烤烟（G28）杂交后代稳定品系的表面分泌物检测及烤后烟叶感官鉴定分析，明确了大白筋599特异香气性状形成的主要物质基础是赖百当二萜冷杉醇。研究结果很好的印证了以往对大白筋599的认识，如：大白筋599香气特性类似香料烟Samsun而不是Basma，原因可能是Samsun中含有冷杉醇而Basma中不含：大白筋599田间生育期就能散发出特异香味，原因可能是冷杉醇在烟草腺毛中特异合成后，从腺毛中分泌到烟叶表面，并降解生成挥发性致香成分所致（冷杉醇在常温下即可降解，而西柏烷二萜和糖酯等腺毛分泌物在常温下不易降解）：此外，嫁接实验表明，大白筋599特异香气性状的有无与接穗品种有关，而与砧木品种无关，原因可能是由于冷杉醇是在烟株地上部分的腺毛中特异合成所致。从遗传角度分析，前期研究认为，大白筋599特异香气质的遗传受单显性基因控制，这与之前国外遗传研究认为冷杉醇合成受单显性基因控制的结果一致。直到2012年，SALLAUD等研究揭示了冷杉醇合成受两个基因调控，并且缺一不可。造成冷杉醇遗传研究结果和实际调控基因不一致的原因，之前研究结果认为是：冷杉醇的合成虽受两个基因调控，但NtABS基因在各品种中均存在，并具有正常功能，仅是NtCPS2基因的序列多态性导致了品种间冷杉醇含量有无的差异，所以从遗传角度看，就出现了冷杉醇（或大白筋599特异香气质）仅受1对单基因控制的表现。

本研究结果表明，大白筋599中NtCPS2基因第292位碱基是野生型G而不是突变型T，是其能合成冷杉醇的关键分子基础。同时大白筋599和主栽品种NtCPS2基因的测序结果对比也表明，NtCPS2基因的SNP突变，可能是导致大部分主栽烟草品种不含冷杉醇的重要原因。SALLAUD等对150多份烟草品种的研究结果表明，NtCPS2基因在烟草品种中虽有两种突变形式（8碱基1NDEL和SNP），但两种突变在同一品种中不共存，并且90%以上品种属于SNP突变类型。本研究涉及的煙草品种中，NtCPS2基因均是SNP突变，与SALLAUD等的研究结果一致。目前已针对NtCPS2基因（调控冷杉醇合成的关键基因）开发了SNP分子标记，利用开发的分子标记对40多份烤烟种质资源和近100份中烟100的EMS突变体新品系进行了筛选，从中筛选出烤烟品种革新三号和一个突变体品系含有冷杉醇标记，经表面分泌物表型验证，两个材料确实含有冷杉醇。并且经测序验证，两个种质中NtCPS2基因的第292位碱基均是野生型G。根据相关文献记载，革新三号也是田间具有特异香味的特香型品种。筛选出的含有冷杉醇的中烟100突变体新品系，具有沙姆逊（samsun）特征香韵，待后续开发利用。

国外大量研究表明，冷杉醇是烟草表面分泌物重要致香前体物，其降解产物主要是降龙涎香醚、龙涎香内酯等具有强烈龙涎香香气的物质，常用于烟草浸膏中，对增加卷烟香气和吸味非常有效。通常情况下，普通烤烟一般不含冷杉醇，其主要存在于香料烟和雪茄烟中，由于不同烟草类型间主要植物学、农艺性状等差异较大，导致香料烟和雪茄烟向烤烟中转移这种特异香气性状时，易带进不利连锁，且耗时耗力。本研究明确冷杉醇是大白筋599关键致香物质基础，并且明确NtCPS2基因第292位碱基的单核苷酸突变是导致生产主栽烤烟品种不含冷杉醇的主要原因。这些研究结果，将为今后通过分子育种手段快速培育含有冷杉醇的特色香气烤烟品种提供较好的基础。

烟草表面分泌物的主要成分是萜类和糖酯等致香前体物，其中赖百当二萜和糖酯在不同烟草品种类型间存在较大的差异，这些差异成分的降解产物对烟草香气品质具有重要贡献，是不同类型烟草香气风格特色形成的重要物质基础。通过遗传改良，丰富烟草表面分泌致香前体物种类或含量，可以改变烟叶的香气风格特色，改善烟叶香气品质，是培育特色香气烤烟新品种的有效途径。

4结论

研究表明，赖百当二萜冷杉醇是大白筋599特异香气性状的关键致香物质基础：调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2的序列差异（SNP）是大白筋599含有冷杉醇而生产主栽品种不含冷杉醇，进而导致其香气风格特色不同的分子基础。