柯智健　张月凤　艾莹飞　李晓宇　柳志强

摘要

G蛋白（G protein/GTP binding protein）是能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有水解GTP 生成GDP，即具有GTP 酶（GTPase）活性的蛋白。G蛋白在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用，然而目前還未有关于胶孢炭疽菌G蛋白生物学功能的研究。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了一个G蛋白α亚基中的基因CgGα2，该基因编码一个354个氨基酸的蛋白，含有一个G_alpha的功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体，并且在此基础上得到了突变株的互补株，将两者与野生型相比，突变体表现为营养生长缓慢，产孢量减少，对NaCl和H2O2更加敏感，对SDS的耐受性增加，对致病力无明显影响。以上结果表明，CgGα2参与调控胶孢炭疽菌的营养生长及分生孢子产生，并可能与该病菌的渗透压响应及氧化应激反应有关。

关键词

胶孢炭疽菌； G蛋白信号途径； Gα亚基； 营养生长； 分生孢子

中图分类号：

S432.44

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017150

Biological function of the G protein αsubunit CgGα2 in

Colletotrichum gloeosporioides

KE Zhijian， ZHANG Yuefeng， AI Yingfei， LI Xiaoyu， LIU Zhiqiang

（Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）

Abstract

G protein， which has the activity of GTPase， is able to bind to guanine nucleotide， and has the ability to hydrolyze GTP to GDP. G protein plays an important role in growth， development and pathogenicity of plant pathogens， but there has been no studies on the biological functions of G protein in Colletotrichum gloeosporioides so far. In this study， one of the G protein αsubunit gene CgGα2 was cloned from C.gloeosporioides. CgGα2 encoded a 354amino acid protein and contained a functional domain of G_alpha. The knockout mutant of CgGα2 was obtained by homologous recombination， and the complementary strain was obtained from the knockout mutant. Compared to the wild type and complementary strain， the knockout mutant of CgGα2 resulted in slow vegetative growth， decreased conidium production， more sensitive to NaCl and H2O2， and more tolerant to SDS.CgGα2 had no effect on the virulence of C.gloeosporioides. These results suggest that CgGα2 is involved in regulating vegetative growth and conidiation， and it might also be involved in osmotic pressure and oxidative stress response of C.gloeosporioides.

Key words

Colletotrichum gloeosporioides； G protein signaling pathway； Gα subunit； vegetative growth； conidium

炭疽菌属Colletotrichum Corda由Corda于1831年建立，其分类地位在Ainsworth系统中，隶属于真菌门Eumycota，半知菌亚门Deuteromycotina，腔孢纲Coelomycetes，黑盘孢目Melanconiales，黑盘孢科Melanconiaceae[1]，其广泛分布于温带、亚热带和热带地区，是引起植物炭疽病害的一类重要的植物病原真菌。炭疽菌通常出现在春季和夏季，主要危害木本植物地上部分的叶片和果实，引起早期落叶、落果[2]。胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides是一种重要的炭疽病菌，该病菌不但寄主范围广，而且有各种各样的侵染策略，目前防治该病菌较为困难[3]。因此，探究该菌在侵染过程中相关基因的功能对有效防治该病菌具有重要的理论和实践意义。

G蛋白（G protein/GTP binding protein）能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有GTP酶（GTPase）活性，可水解GTP生成GDP[4]。 G蛋白是一个超级家族（GTPbinding proteins superfamily），包括膜受体偶联的异源三聚体G蛋白（heterotrimeric GTP binding protein）和小G蛋白（Small GTPbinding Proteins）[5]。其中异源三聚体G蛋白是由α、β、γ 3种亚基组成，α亚基单体分子量为39～52 kD，β和γ亚基分子量分别为35～37 kD和6～10 kD；不同的G蛋白由不同的基因编码，不过β、γ亚基尽管是两个不同基因的产物，但在自然状态下，两者以非共价紧密结合，只有在变性条件下才能分开[6]。

异源三聚体G蛋白在真核生物中几乎都是保守的，它们能够感知和传递胞外信号进入细胞内，并引发相应的生理和生化应答过程[7]。在不同的真菌中G蛋白α亚基存在着多种类型，如稻瘟病菌Magnaporthe oryzae存在着magA、magB、magC三種Gα亚基，香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cubense中也存在着三种Gα亚基，分别为fga1、fga2、fga3。除此之外，包括粗糙脉胞菌Neurospora crassa、小麦赤霉菌Gibberella zeae、构巢曲霉Aspergillus nidulans等丝状真菌中也存在着多种不同的Gα亚基。Gα（GTP）亚基是许多效应器的激活剂，从其初级结构分析得知，它们具有一致的保守区和多变区[8]。目前，Gα亚基在稻瘟病菌M.oryzae[9]、粗糙脉孢菌N. crassa[10]、小麦条锈病菌Puccinia striiformis[11]等病原真菌中得到鉴定，它们在参与调控营养生长，孢子产生、附着胞形成及致病性等方面发挥不同的作用。然而目前还未有关于胶孢炭疽菌G蛋白生物学功能的研究。在前期研究中，我们从胶孢炭疽菌中鉴定了三种Gα亚基，分别命名为CgGα1、CgGα2和CgGα3，本研究对其中一个Gα亚基CgGα2的生物学功能进行了分析。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：胶孢炭疽菌C.gloeosporioides野生型菌株（WT）由海南大学热带农林学院保存。

PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉18 g/L。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂粉18 g/L。CM培养基：胰蛋白胨6 g/L、酵母提取物6 g/L、蔗糖10 g/L、琼脂粉18 g/L。Czapek培养基：蔗糖30 g/L、NaNO3 3 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO41 g/L、FeSO4 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、琼脂粉18 g/L。MM培养基：葡萄糖10 g/L、NaNO3 1 g/L、MgSO4 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、琼脂粉18 g/L。

1.2 CgGα2基因克隆及生物信息学分析

基因组提取利用CTAB法[12]。提取RNA用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extracton Kit （TaKaRa，中国）试剂盒。利用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit （TaKaRa，中国）合成cDNA。以GenBank中草莓胶孢炭疽菌C.gloeosporioides Nara gc5 G protein alpha subunit （XP_007283616）基因的ORF框序列作为参照来设计引物CgGα2F/CgGα2R（表1），以野生型基因组DNA和cDNA作为模板，利用PCR扩增CgGα2基因的DNA和cDNA序列。将扩增产物进行割胶回收纯化，连接，转化以及酶切鉴定之后送上海生工测序公司测序。利用SMART（http：∥smart.emblheidelberg.de/）工具对CgGα2进行蛋白结构域分析。利用BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析蛋白的同源性，利用MEGA 5.0软件以邻近相接法（Neighborjoining， NJ）构建系统发育树。

1.3 CgGα2基因的敲除及突变体的鉴定

以野生型基因组DNA作为模板，分别以CgCα2upF和CgCα2upR，CgCα2downF和CgCα2downR（表1）作为引物扩增CgGα2基因的上下游片段。将上下游片段通过酶切回收后，与载体pCB1532（含氯嘧磺隆抗性基因Sur）连接，获得敲除载体pCB1532CgGα2。图1为CgGα2基因同源置换的原理。将敲除载体通过BamH Ⅰ酶切线性化，转化到胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的野生型菌株的原生质体中，原生质体的制备及转化的方法参照Liu等[13]。转化子在含有100 μg/mL氯嘧磺隆抗性标记的平板上筛选。提取抗性转化子的基因组。以CgGα2基因上游序列的上翼序列和下游序列的下翼序列分别设计引物CgGα2UU和CgGα2DD（表1），随后以pCB1532上靠近上游和下游的片段，分别设计引物PI和PI1（表1）。利用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1，CgGα2F和CgGα2R这三对引物对转化子进行PCR鉴定。使用CgGα2F和CgGα2R引物扩增后，无扩增条带，而使用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1引物扩增后出现目的条带的转化子为基因敲除突变体。

以野生型菌株的基因组DNA作为PCR扩增的模板，以CgGα2hbF和CgGα2hbR作为引物扩增CgGα2基因的互补片段，将其与潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的DNA片段相连，然后连接到pUC18质粒上，得到互补载体pUC18CgGα2。将载体转化到CgGα2敲除突变体制备的原生质体中，转化方法如上所述。将转化子在含有潮霉素（300 μg/mL）的平板上筛选。提取转化子基因组DNA，以CgGα2F 和CgGα2R作为引物，进行PCR验证，能扩增出CgGα2基因片段的为互补转化子。

1.4 营养生长测定

使用0.5 cm直径的打孔器在野生型菌株、敲除突变体和互补株的菌落边缘打取菌饼，分别接种到PDA、CM、MM、Czapek平板上，28℃培养7 d，量取菌落直径并拍照，试验重复3次，每次试验设3个重复。

1.5 产孢量、孢子萌发率和附着胞形成率测定

取PDA培养基上培养10 d的野生型菌株、敲除突变体和互补株的平板，利用涂布棒刮去菌丝，在28℃下光照培养4 d，诱导其产生分生孢子。向培养基中加入10 mL含有2%吐温80的无菌水冲洗孢子，然后利用脱脂棉过滤孢子液，使用血球计数板统计分生孢子数量。将40 μL野生型、敲除突变体和互补株的孢子悬浮液滴在灭菌的玻璃载玻片上，28℃培养4 h后，在显微镜下观察，计算孢子萌发率，培养8 h后，计算附着胞形成率。试验重复3次，每次试验设3个重复。

1.6 胁迫因子敏感性分析

野生型菌株、敲除突变体和互补株在PDA上生长7 d后，利用打孔器打取0.5 cm的菌饼，分别接种在含有NaCl （0.5、0.8、1 mol/L），H2O2（10、20、30 mmol/L），SDS （0.01%，0.02%，0.03%）的MM平板上，在28℃下培养7 d后测量菌落直径，计算其抑制率，抑制率=（对照组菌落直径试验组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。试验重复3次，每次试验设3个重复。

1.7 致病性试验

挑选生长健康的芒果，用70%的乙醇对芒果表面进行消毒。将处理后的芒果放置在保鲜盒中，保鲜盒底部用双层湿润的滤纸保湿。使用0.5 cm直径的打孔器在野生型菌株、敲除突变体和互补株菌株的边缘打取菌饼。分别以无伤口和有伤口的方式接种在芒果上，6 d后观察致病情况。试验重复3次，每次试验设3个重复。

2 结果与分析

2.1 CgGα2基因克隆及生物信息学分析

以胶孢炭疽菌野生型菌株的cDNA作为模板，利用PCR技术扩增CgGα2基因cDNA片段。测序结果表明，CgGα2基因编码354个氨基酸。通过SMART工具分析发现其含有一个G_alpha的功能域 （图2a）。CgGα2蛋白在炭疽菌属内相对保守，与C.chlorophyti （OLN85919），C.higginsianum （XP_018155894） 中同源蛋白的相似度都在90%以上，同时发现其与粗糙脉胞菌N.crassa （AAD01207） 中同源蛋白有着77%的相似度，与大豆疫霉Phytophthora sojae （XP_009515731） 和小麦条锈病菌P. striiformis f.sp. tritici （KNE88994） 相关同源蛋白也有着40%～50%的同源性。CgGα2的系统发育树见图2b。

2.2 CgGα2基因的敲除及验证

为了明确CgGα2基因的生物学功能，本研究组构建了pCB1532CgGα2载体，利用限制性内切酶线性化之后导入野生型的原生质体中。通过原生质体转化的方法，共得到了112个具有氯嘧磺隆抗性的转化子。提取转化子基因组DNA，分别用CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1，CgGα2F和CgGα2R为引物进行PCR验证。结果显示102号转化子以CgGα2UU和PI，CgGα2DD和PI1为引物时可扩增出1 500 bp左右的目的条带，而以CgGα2F和CgGα2R作为引物时无扩增条带（图3）。因此确定102号转化子为敲除突变体，命名为ΔCgGα2102。

将构建的互补载体pUC18CgGα2转化到敲除突变体ΔCgGα2102的原生质体中，在含有潮霉素的平板上筛选，得到24个抗性转化子，通过PCR验证，发现4号转化子能够扩增出CgGα2基因片段（图3），因此确定其为互补转化子，将其命名为ΔCgGα2/gα2。

2.3 营养生长

将野生型、ΔCgGα2102和ΔCgGα2/gα2菌株分别接种到PDA、MM、CM和Czapek培养基上，培养7 d观察其生长情况。如图4所显示，突变体ΔCgGα2102在以上4种培养基上生长缓慢。尤其是在营养更为贫瘠的Czapek和MM培养基上，突变体的生长速率显著降低。由此可见CgGα2参与调控胶孢炭疽菌的营养生长。

2.4 产孢量、孢子萌发率及附着胞形成率

通过上述方法测定产孢量。结果如表2显示，ΔCgGα2102的产孢量与野生型和互补株存在着显著差异。野生型的产孢量平均为3.57×106个/mL，互补株为3.38×106个/mL 而ΔCgGα2102的产孢量平均为2.10×105个/mL，仅为野生型的1/17。ΔCgGα2102的孢子萌发率以及附着胞形成率与野生型无显著差异。由此可见，CgGα2参与调节了分生孢子的产量。

2.5 胁迫因子的影响

测试了不同胁迫因子对于突变体ΔCgGα2102生长的影响，结果如图5所示。从图5a可以看出，随浓度的增加，NaCl对突变体ΔCgGα2102的抑制率始终要大于野生型和互补株。在含H2O2的MM培养基上， 敲除突变体ΔCgGα2102對H2O2更加敏感，抑制率显著大于野生型菌株和互补株ΔCgGα2/gα2；在含SDS的培养基上，突变体ΔCgGα2102对SDS较野生型和互补株ΔCgGα2/gα2有较大的耐受性，且随着SDS浓度的增大，突变体ΔCgGα2102的耐受性始终大于野生型和互补株ΔCgGα2/gα2。

2.6 致病性

将野生型、突变体ΔCgGα2102和互补株ΔCgGα2/gα2的菌饼接种于芒果上，保湿培养6 d，致病情况如图6所示。从图中可以看出，无论是有伤口接种还是无伤口接种，突变体ΔCgGα2102所造成的病斑大小都和野生型及互补株ΔCgGα2/gα2的差异不大。因此，CgGα2并不影响胶孢炭疽菌的致病力。

3 讨论

G蛋白偶联的信号传递通路是细胞信号转导中的重要途径，通过跨膜受体识别胞外信号并将其转化为胞内应答，其中G蛋白偶联的跨膜受体形成了最大的信号家族[14]。Gα亚基是一种功能亚基，不同的Gα亚基就构成了不同的G蛋白。研究发现真菌中存在着多个Gα亚基，参与调控营养生长、孢子产量、孢子萌发、附着胞形成、渗透压响应、致病性等多个方面。本研究通过同源置换成功获得CgGα2敲除突变体，表型分析发现突变体的营养生长减缓，但在不同的培养基上其生长速率不同，这可能与培养基的营养成分有关。相对于PDA和CM，Czapek和MM培养基的营养成分相对匮乏，使突变体的营养生长缺陷表现得更为明显。同时突变体的产孢量减少，但其孢子萌发和附着胞形成却没有受到影响，说明了CgGα2基因仅仅参与调控胶孢炭疽菌C.gloeosporioides分生孢子产生，而并不影响其萌发过程。在胁迫试验中，突变体对于NaCl和H2O2都更加敏感，而且突变体对于SDS的耐受性要强于野生型，这说明CgGα2基因参与调控了渗透压响应及氧化应激反应。在致病性试验中，突变体可以使芒果致病，病斑和野生型无明显差异，说明了CgGα2基因并不影响其致病性。

研究发现，Gα亚基在不同真菌中起到了不同的作用。在稻瘟病菌M.oryzae中，Gα亚基影响其营养生长、产孢、孢子萌发、附着胞的分化以及致病性；其中CgGα2同源蛋白magC参与了稻瘟病菌的产孢，但不影响附着胞萌发，在这点上和CgGα2的功能是一致的，但magC蛋白却并不影响稻瘟病菌的营养生长[9]。bcg2亚基是灰葡萄球菌Botrytis cinerea的一个Gα亚基，其被敲除后，菌落形态无明显变化，但致病性降低[15]。在粗糙脉胞菌N. rassa中Gα亚基影响了分生孢子的产生和胞内腺苷酸环化酶的水平[10]；在草酸青霉Penicillium oxalicum中，Gα亚基缺失突变体在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上出现菌落变小，颜色变深的现象[16]；在玉米大斑病菌Setosphaeria turcica中，Gα亚基缺失后，会出现菌落低矮，气生菌丝稠密等表型[17]。

Gα亚基所在的G蛋白信号转导途径是生物体中重要的信号感应和应答系统，该系统是由G蛋白偶联受体（G proteincoupled receptors，GPCRs）、异源三聚体G蛋白、下游效应分子以及信号调控蛋白组成[18]。目前已知在胶孢炭疽菌存在8个GPCR蛋白，其中碳源感应因子类有3个；类cAMP受体类有2个，信息素受体、氮源感应因子和真菌视蛋白类各1个[19]。活化的G蛋白通过下游效应分子进行信号传递，这一过程主要包含3条信号通路：cAMPPKA 途径、MAP （mitogenactivated protein）激酶途径和IP3Ca2+/DAGPKC途径[20]。CgPKAC基因位于cAMPPKA途径上，当该基因缺失时，附着胞形成被延迟，疏水表面的附着能力减弱，致病性也减弱[21]。RGS蛋白对G蛋白信号传导途径起到了负调控作用。已报道的胶孢炭疽菌C.gloeosporioides CgRGS2和CgRGS4蛋白，参与调控胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的营养生长，分生孢子产量及萌发，氧化应激反应，细胞壁完整性，以及致病性[2223]。而本文所研究的CgGα2基因虽然并不影响胶孢炭疽菌的致病性，但参与调控了营养生长和分生孢子产量。总的来说，目前关于胶孢炭疽菌C.gloeosporioides G蛋白信号转导途径的研究还处于起步阶段，也未有关于G蛋白α亚基相关功能的报道，本研究对于深入解析胶孢炭疽菌C.gloeosporioides G蛋白的调控机制奠定了一定基础。

参考文献

[1] 张中义，刘云龙，刘媛，等.中国炭疽菌属（Colletotrichum）的分类研究Ⅰ[J].石河子大学学报（自然科学版），2004，22（S1）：178181.

[2] 向梅梅，张云霞，刘霄.炭疽菌属真菌分类的研究进展[J].仲恺农业工程学院学报，2016，29（4）：18.

[3] 韩长志.胶孢炭疽菌侵染过程相关基因研究进展[J].广东农业科学，2014（9）：165169.

[4] 胡蓉，陈党生.G蛋白及生理功能[J].内江师范学院学报，2011，26（6）：3238.

[5] 陈巨莲，WENG Gezhi，倪汉祥.G蛋白及其偶联信号传导途径的研究进展[J].生物工程学报，2001，17（2）：113117.

[6] WU Weihua， ZHAO Yunyun. GTPbinding regulatory proteins in higher plant cell [J].Acta Botanica Sinica，1996，38（5）：406413.

[7] 赵勇， 王云川， 蒋德伟， 等. 真菌G蛋白信号调控蛋白的功能研究进展[J]. 微生物学通报， 2014， 41（4）： 712718.

[8] 李利， 陈莎， 毛涛， 等. 丝状真菌G蛋白信号途径的研究进展[J]. 微生物学通报， 2013， 40（8）： 14931507.

[9] LIU Shao， RALPH A D. G Protein a subunit genes control growth， development and pathogenicity of Magnaporthe grisea [J]. Molecular PlantMicrobe Interactions， 1997， 10（9）： 10751086.

[10]ANN M， KAYS， PATRICIA S， et al. Regulation of conidiation and adenylyl cyclase levels by the Gα protein GNA3 in Neurospora crassa [J]. Molecular and Cellular Biology， 2000， 20（20）： 76937705.

[11]楊静静， 李星， 李亚宁， 等. 小G蛋白Rab2基因参与小麦抗叶锈病反应的研究[J]. 华北农学报， 2010， 25（4）： 15.

[12]TALBOT N J， EBBOLE D J， HAMER J E.Identification and characterization of MPGI， a gene involved in pathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J].Plant Cell，1993， 5（11）： 15751590.

[13]LIU Zhaohui， FRIESEN T L. Polyethylene glycol （PEG）mediated transformation in filamentous fungal pathogens [J]. Methods in Molecular Biology， 2012， 835： 365375.

[14]卢汀， 刘倩. G蛋白偶联信号转导通路及βarrestin在信号转导中的作用[J]. 生命科学研究， 2006， 10（2）： 79.

[15]GRONOVER C S， KASULKE D， TUDZYNSKI P. The role of G protein α subunits in the infection process of the gray mold fungus Botrytis cinerea [J]. Molecular PlantMicrobe Interactions， 2001， 14（11）： 12931302.

[16]HU Yibo， LIU Guodong， LI Zhonghai， et al. G proteincAMP signaling pathway mediated by PGA3 plays opposite roles in regulating the expressions of amylases and cellulases in Penicillum decumbens [J].Fungal Genetics and Biology，2013，58：6270.

[17]郝志敏， 申珅， 李志勇， 等. 玉米大斑病菌Stga2及其启动子的克隆与基因表达分析[J]. 中国农业科学， 2010， 43（18）： 37053712.

[18]TAKAO K， AKAGI Y， TSUGE T. Functional characterization of putative G proteincoupled receptors in the tomato pathotype of Alternaria alternate [J]. Journal of General Plant Pathology， 2016， 82（2）： 17.

[19]张丽勍，段可，邹小花，等.草莓胶孢炭疽菌GPCRs超家族蛋白鉴定及生物信息学分析[J].上海农业学报，2017，33（1）：19.

[20]YU J H. Heterotrimeric G protein signaling and RGSs in Aspergillus nidulans [J]. Journal of Microbiology， 2006， 44（2）： 145154.

[21]PRIYATNO T P， BAKAR F D A， KAMARUDDIN N， et al. Inactivation of the catalytic subunit of cAMPdependent protein kinase a causes delayed appressorium formation and reduced pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides [J]. The Scientific World Journal， 2012， ID 545784.

[22]吳曼莉， 李晓宇， 张楠， 等. 胶孢炭疽菌CgRGS2基因的克隆及生物学功能[J]. 微生物学报， 2017， 57（1）： 6676.

[23]徐爽， 吴曼莉， 柯智健， 等. 胶孢炭疽菌CgRGS4调控营养生长、渗透压响应、氧化应激反应和致病性[J]. 浙江农业学报， 2017， 29（2）： 277285.

（责任编辑：田 喆）