袁新敏 青 松 金 小 包金莲

(1.内蒙古自治区食品药品检验所,内蒙古 呼和浩特 010020； 2.乌兰浩特中蒙制药有限公司,内蒙古 乌兰浩特 137400)

小儿石蔻散是由石榴、缩阳、萹蓄、红花、龙骨(煅)、大蒜(炭)、黑冰片(炭)、肉桂、荜茇、五灵脂(炭)、豆蔻、益智、寒水石(制)等13味药组成的复方蒙药制剂，用于治疗轻、中型小儿轮状病毒性肠炎，蒙医辨证为巴达干协日者，为乌兰浩特中蒙制药有限公司独家生产的蒙药制剂品种。现行质量标准只规定了石榴与荜茇的含量测定项。红花作为处方中起活血通经、散瘀止痛、抗炎的主味药，并未收载含量测定项。据文献记载[1]红花中含有红花苷、红花黄色素、多种酚类及挥发性活性成分，红花黄色素具有抗凝血、镇静、镇痛、抗缺氧、抗炎等作用。《中国药典》[2]收载的红花含量测定项下为测定羟基红花黄色素A。因此本文对制剂中红花所含羟基红花黄色素A进行了HPLC含量测定方法研究。经方法学考察及阴性对照试验，表明此法专属性强，重现性好，可作为小儿石蔻散中红花的含量测定方法。

1 材料

1.1 样品来源 样品由乌兰浩特中蒙制药有限公司提供(批号151111、151112、151113)。

1.2 仪器 戴安UltiMate 3000型高效液相色谱仪，DAD检测器，变色龙色谱工作站。

1.3 试剂与试药 羟基红花黄色素A对照品(批号：111637-200905)购自中国食品药品检定研究院；甲醇为分析纯和色谱纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 分析方法验证

2.1 色谱条件 色谱柱：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相色谱柱，填料粒径5μm，本实验研究采用Alltima C18柱(250mm×4.6mm,5μ)色谱柱；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26：2：72)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长为403nm；理论板数按羟基红花黄色素A峰计应不低于3000。

2.2 供试品溶液的制备 取本品约4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率50Hz)40min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇制成每1mL约含60μg的溶液，即得。

3.4 阴性对照试验 取按处方量并以相同工艺制备的阴性对照样品(缺红花)4g，按上述色谱条件及制备方法操作，进样量10μL。测得结果为：阴性对照色谱图中在羟基红花黄色素A对照品色谱峰相对应的保留时间处无色谱峰出现。表明其它药味对羟基红花黄色素A的测定无干扰。见图1、2、3。

图1 阴性对照色谱

图2 对照品色谱

图3 供试品色谱

2.5 线性关系考察 精密称取羟基红花黄色素A对照品6.811mg，置25mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(浓度为0.2724mg/mL)。分别精密吸取2μL、5μL、10μL、20μL、30μL，按上述色谱条件进样，测定，以峰面积积分值对进样量进行回归分析，结果羟基红花黄色素A在272.4ng～8173ng范围内呈良好的线性关系。回归方程为Y=6.6676X+0.2445，r=0.99999。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后进样测定，结果羟基红花黄色素A在24h内的峰面积积分值基本稳定不变。RSD为0.3%，具有较好的稳定性。

2.7 重复性试验 取同一批号(批号151111)供试品6份，各取约4.0g，分别按上述色谱条件及制备方法操作，测定每份含量，结果平均含量为0.6863mg/g,RSD为0.9%，重复性良好。

2.8 加样回收试验 取供试品(批号151111)，含量0.6863mg/g)6份，各约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别依次精密加入羟基红花黄色素A对照品1.4mg，再精密加入25%甲醇50mL，摇匀，称定重量，分别按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定每份含量,计算回收率，结果见表1。

表1 羟基红花黄色素A加样回收试验结果

3 样品含量测定

取本品按上述色谱条件及制备方法操作并测定，3批样品的测定结果见表2。

表2 样品中羟基红花黄色素A含量测定结果

4 讨论

4.1 提取效率考察 取6份样品分别超声处理(功率为250w,频率为50KHZ)10min、20min、30min、40min、50min，60min,其余操作按上述色谱条件及制备方法测定，结果超声处理40min后，羟基红花黄色素A的含量基本不再增加，故确定超声时间为40min。

4.2 检测波长的选择 取羟基红花黄色素A对照品适量，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，通过二极管阵列检测器，自190nm～700nm进行光谱扫描，结果羟基红花黄色素A在403nm处有最大吸收并无干扰。结合《中国药典》2015年版一部红花药材项下含量测定方法，采用403nm作为检测波长。

4.3 色谱条件耐用性考察 采用Alltima C18柱(250mm×4.6mm,5μ)和Shim-pack C18柱(250 mm × 4.6mm,5μ)两种品牌色谱柱,按确定的色谱条件进行测定，结果分离效果好，测定结果一致。

4.4 运用HPLC法测定小儿石蔻散中羟基红花黄色素A的含量，方法简便、分离良好、结果准确，为全面客观地建立小儿石蔻散质量标准提供了依据。

[1]常全新,丁丽霞.中药活性成分分子手册[M].下册.学苑出版社,2002:1997.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.中国中医药科技出版社，2015：151.