张菁华，周永翠，唐爱发*

(1.中山大学中山医学院，广州 510275；2.深圳市第二人民医院转化医学研究院，深圳 518037)

本实验室前期研究中，采用Affymetrix公司的小鼠全基因组表达谱芯片筛选出一批睾丸特异性表达新基因，其中一个睾丸特异性基因是SPACA7(原命名为T279)，小鼠不同组织、器官、细胞系的高通量基因表达模式显示，SPACA7仅在睾丸组织中特异表达[1]。SPACA7属于精子顶体结合蛋白家族成员，该蛋白家族成员只有SPACA3和SPACA5具有较高的氨基酸同源性，其它成员同源性不高。有报道表明，在小鼠雄性生殖细胞发生过程中有超过50%的基因组基因发生表达，但是仅仅只有4%的基因组基因发生转录。基因转录调控对于该基因的时空表达以及表达强度等至关重要，本文旨在通过分析SPACA7 16对启动子的转录活性，筛选SPACA7的有效启动子，为日后研究SPACA7的基因转录调控做基础。

资料与方法

一、研究对象及试剂

1.研究对象：人肾上皮细胞293T(购自美国模式培养物集存库ATCC，CRL-3216)。

2.主要试剂：pGL3-basic、Renilla质粒和Dual-Luciferase Reporter Assay System购自美国Promega公司；逆转录试剂盒、高保真DNA聚合酶primer STAR、DNA聚合酶ExTaq以及相关PCR试剂购自日本TakaRa公司；RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自美国QIAGEN公司；限制性内切酶XhoⅠ、HindⅢ 和T4DNA连接酶购自美国New England Biolabs公司；无内毒素质粒大量抽提试剂盒和Lipofectamine 2000脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司；胎牛血清及培养基购自美国Gibco公司。

3.主要仪器：PCR仪(ABI Veriti，美国)、凝胶成像系统(Bio-Rad GelDoc，美国)、酶标仪(THERMO FISHER Multiskan FC，美国)。

二、实验方法

1.SPACA7基因启动子序列获取及引物设计和合成：使用Promoter 2.0和Neural Network Promoter Prediction对SPACA7基因启动子进行分析，在NCBI的GeneBank中查找，获取人类SPACA7基因转录起始位点上游2000 bp与下游84 bp序列。……