覃黎葵，张奉学，黄笑娟，宋鸿，龚文亮

1.广州中医药大学祈福医院，广东 广州 511495；2.广州中医药大学基础医学院，广东 广州 511006

呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的小儿呼吸系统疾病是世界范围的一个主要公共健康问题[1]。RSV感染是导致婴幼儿下呼吸道感染、细支气管炎和肺炎最主要的病原体，也是世界范围内儿童流行性呼吸道疾病的主要感染因素之一[2～3]。目前仍没有令人信服的安全的针对该病毒的疫苗，也没有行之有效的抗病毒治疗手段[4～5]。在长期的实践中，中医在防治RSV方面积累了丰富的经验。现代医学研究发现银翘散有抗菌、抗病毒、抗炎的作用[6]。本研究建立RSV感染小鼠呼吸系统动物模型，通过对肺指数进行测定，HE染色观察肺组织和鼻黏膜组织的炎性浸润等病理形态学改变，检测炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达，实时荧光定量PCR和Western blot检测肺组织NALP3炎性体(NALP3)、凋亡相关微粒蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1(caspase-1)的表达，从体内水平分析银翘散治疗RSV感染的疗效及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞和动物 健康BALB/c小鼠54只，6～8周龄，体质量为18～20 g，雌雄各半，由广东省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2008A023。HEp-2细胞系(人喉癌上皮细胞)购自中科院上海细胞库。RSV-Long毒株购自中国预防医学科学院病毒学研究所。实验在暨南大学动物实验中心进行。

1.1.2 实验药物 银翘散配方：连翘、金银花各30g，苦桔梗、牛蒡子、薄荷各18 g，竹叶、荆芥穗各12 g，淡豆豉、芦根、生甘草各15 g，中药饮片均购于北京同仁堂。金银花、桔梗粉碎成细粉，过五号筛，为成分Ⅰ；薄荷、荆芥提取挥发油，为成分Ⅱ，蒸馏后的水溶液另用容器收集，为成分Ⅲ；药渣与余6味药加10倍量水煎煮2次，每次1 h，滤过，合并滤液，为成分Ⅳ。合并成分Ⅰ～Ⅳ，混勾，制成2.42 g(生药)/mL药液，冷冻干燥，3天后回收71.34 g褐色粉末，置-20℃保存备用。给药时用蒸馏水配制成相应的浓度。利巴韦林片购自江西汇仁药业有限公司，批号1302009，给药时用蒸馏水配制成相应的浓度。

1.1.3 主要试剂及仪器 高糖型DMEM培养基(GIBCO)；胎牛血清(FBS，Hyclone)；琼脂糖(上海生化试剂公司)；Trizol(Takara)。RT-PCR试剂，DBI公司产品；DEPC，美国Sigma公司产品；RNasin，美国Promega公司产品；逆转录试剂盒，DBI公司产品。抗NALP3抗体、抗ASC抗体和抗caspase-1抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司；二抗HRP Goatanti-RabbitIgG 购 自 BOSTER。 Tris-base、Glycine、SDS(十二烷基硫酸钠)，上海生工生物工程有限公司。酶联免疫吸试剂盒(ELISA)购于TaKaRa公司，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟、溴汾蓝购于Genebase。BCA蛋白浓度测定试剂盒、过硫酸铵、TWEEN-20(吐温)、二硫代苏糖醇、NaCl购自威佳科技。BSA购于Amresco；四甲基乙二胺购自晶欣生物科技有限公司；蛋白定量试剂盒购于Thermo；PVDF膜购于Millipore；医用X-光片，广西巨星医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、建模及干预 BALB/c小鼠随机分为6组，每组9只，分别是正常组、模型组、银翘散高剂量组、银翘散中剂量组、银翘散低剂量组、利巴韦林组。银翘散高、中、低剂量组分别给予 600 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)银翘散灌胃，利巴韦林组给予150 mg/(kg·d)利巴韦林灌胃，给药体积均为0.1 mL/10 g。各组小鼠用乙醚浅麻后，以浓度TCID50(TCID50=10-7.5/mL)RSV病毒液50 μL滴鼻感染小鼠。银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组于感染前1天开始灌胃给药，连续5天，正常组、模型组给予等容积蒸馏水灌胃。

1.2.2 肺重及肺指数的测定 感染后第5天，称量每只小鼠的体质量并记录，杀死并解剖小鼠，取出鼠肺，详细记录病变程度，将鼠肺放在盛有生理盐水的平碟中洗2次，用吸水纸吸干表面水分，称量肺重，计算出肺指数，肺指数=(小鼠肺重/小鼠体质量)×100%。

1.2.3 肺组织病理检查 取部分肺组织放入液氮速冻，然后转入-80℃冰箱保存，取鼻黏膜及部分肺组织放入4%甲醛固定。常规病理组织脱水后，石蜡包埋切片并行HE染色，镜下镜检拍照检查病理变化情况。1.2.4 ELISA法检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6取肺泡灌洗液，使用ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.2.5 qPCR法检测 NALP3、ASC和 caspase-1 mRNA的表达 取肺组织，qPCR检测NALP3、ASC和caspase-1的表达。利用Trizol规范提取组织RNA，-80℃储存备用。计算RNA的纯度及浓度，以2 μg总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系，进行逆转录，合成cDNA第一链，收集备用。根据DBI BestarRSybr Green qPCRmasterMix的说明书配制qPCR扩增的反应体系，PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃20 s，40个循环。融解曲线分析：温度62℃～95℃。每个样重复3次，使用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P进行荧光定量PCR实验。引物序列见表1。

结果按照2-△△Ct方法来计算，利用qPCR技术通过2-△△Ct方法分析相对基因表达差异。其中，△Ct=(目的基因Ct-内参基因Ct)的平均值±标准偏差；△△Ct=(待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct)的平均值±标准偏差(若无参照样品则选择Ct最大的样品为参照进行计算)；相对样品初始模板量=(2-△△Ct)的平均值±标准偏差。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot检测NALP3、ASC和caspase-1蛋白的表达 取肺组织检测NALP3、ASC和caspase-1蛋白的表达。配制相应试剂，取50～100 mg肺组织样本提取总蛋白，置于-80℃冰箱保存，绘制标准曲线，根据所测样品的吸光值及标准曲线回归方程，计算总蛋白含量。将目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜和孵育抗体，接着将抗体孵育后的PVDF膜蛋白面朝上放在保鲜膜上，滴加适量混合液，包好，进行化学发光、显影、定影，最后将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Image-ProPlus 6.0)分析条带净光密度值。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件分析，计量资料以(x±s)表示，多组之间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，采用LSD检验。

2 结果

2.1 各组小鼠肺指数比较 见表2。与正常组比较，模型组小鼠肺指数显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组小鼠肺指数显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与利巴韦林组比较，银翘散低剂量组小鼠肺指数较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组小鼠肺指数比较(x±s)

2.2 各组小鼠鼻黏膜病理形态结果比较 见图1。正常组小鼠表现为纤毛排列十分整齐，而且纤毛粗细均匀一致，并未观测到明显的脱落缺失现象，在固有层没有检测到明显嗜酸性粒细胞浸润。模型组可见大量的纤毛结构脱落，排列散乱，同时组织严重水肿，并且发现鼻黏膜充血十分严重，黏膜上皮下的固有层有明显的嗜酸性粒细胞浸润。与模型组比较，利巴韦林组可见黏膜上皮细胞受损显著减轻，组织水肿和鼻黏膜充血明显减轻，嗜酸性粒细胞的浸润显著减少。银翘散低剂量组可见组织严重水肿，鼻黏膜充血现象略有减少，黏膜上皮下固有层出现嗜酸性粒细胞浸润；银翘散中剂量组部分可见少量黏膜上皮细胞脱落，鼻黏膜充血现象明显减轻；银翘散高剂量组部分可见少量上皮细胞脱落，鼻黏膜充血现象明显减轻，组织水肿及嗜酸粒细胞浸润显著减少。

图1 各组小鼠鼻黏膜病理形态结果比较 (×400)

2.3 各组小鼠肺组织病理形态结果比较 见图2。正常组小鼠肺组织支气管与细支气管周围无炎性细胞浸润，管腔内无炎性细胞及其他分泌物渗出；肺泡隔厚度均匀，未见增粗增厚及肺实变表现，未见毛细血管扩张充血、出血及炎性细胞浸润，肺泡腔内无水肿液及炎性细胞等异物。模型组小鼠肺组织支气管与细支气管周围大量淋巴细胞浸润，管腔内大量单核细胞与淋巴细胞及其他分泌物渗出；肺泡隔显著增宽，薄厚不均，部分表现有肺泡壁毛细血管扩张充血、出血，大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，存在肺实变表现，肺泡腔狭窄或完全被炎性细胞填塞，腔内可见红细胞及淡红色透明水肿液。与模型组比较，利巴韦林组肺泡间隔明显变薄，间质血管扩张、充血以及水肿现象显著减轻，炎性细胞的渗出明显减少。银翘散低剂量组肺泡间隔明显变薄，血管扩张充血略有减轻。银翘散中剂量组病变肺组织减少，病变不明显。银翘散高剂量组肺泡腔的大小十分均匀，肺泡壁完整没有缺失，腔内可见少量红细胞及淡红色透明水肿液。

图2 各组小鼠肺组织病理形态结果比较 (×100)

2.4 各组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子表达水平比较见表3。与正常组比较，模型组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β和IL-6表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与利巴韦林组比较，银翘散中剂量组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β表达较高，银翘散低剂量组小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6表达较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子表达水平比较(x±s)pg/mL

2.5 各组小鼠肺组织NALP3 mRNA及蛋白表达水平比较 见表4、图3。与正常组比较，模型组小鼠肺组织NALP3mRNA、NALP3蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组小鼠肺组织NALP3 mRNA、NALP3蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与利巴韦林组比较，银翘散低剂量组小鼠肺组织NALP3 mRNA、NALP3蛋白表达较高，银翘散中剂量组小鼠肺组织NALP3 mRNA表达较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.6 各组小鼠肺组织ASC mRNA及蛋白表达水平比较 见表5、图4。与正常组比较，模型组小鼠肺组织ASCmRNA、ASC蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组小鼠肺组织ASC mRNA、ASC蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与利巴韦林组比较，银翘散低剂量组小鼠肺组织ASC mRNA、ASC蛋白表达较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.7 各组小鼠肺组织caspase-1 mRNA及蛋白表达水平比较 见表6、图5。与正常组比较，模型组小鼠肺组织caspase-1 mRNA、caspase-1蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，银翘散高、中、低剂量组、利巴韦林组小鼠肺组织caspase-1 mRNA、caspase-1蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与利巴韦林组比较，银

表4 各组小鼠肺组织NALP3 mRNA及蛋白表达水平比较(x±s)

与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与利巴韦林组比较，③P＜0.05翘散中剂量组小鼠肺组织caspase-1 mRNA表达较高，银翘散低剂量组小鼠肺组织caspase-1 mRNA和蛋白表达较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图3 各组小鼠肺组织NALP3蛋白表达结果

表5 各组小鼠肺组织ASC mRNA及蛋白表达水平比较(x±s)

图4 各组小鼠肺组织ASC蛋白表达结果

表6 各组小鼠肺组织caspase-1 mRNA及蛋白表达水平比较(x±s)

图5 各组小鼠肺组织caspase-1蛋白表达结果

3 讨论

目前可供临床选用治疗RSV的药物较少，一直以来，西药方面治疗RSV感染的药物主要有抗病毒药物、支气管扩张剂、激素类抗炎药和免疫调节剂等，但是这些药物都存在比较严重的毒副作用。与西药相比，中药的毒副作用小，药源丰富，可通过调整机体的免疫状态来增强机体抵抗流感病毒的免疫力。

银翘散为中药复方，是中医辛凉解表法的代表方，是临床辨证治疗风热型流感的主要方剂；对流行性感冒、肺炎、支气管炎、扁桃体炎、腮腺炎等属于中医温热病范畴的病毒性感染疾病有切实疗效。其配方由连翘、金银花、桔梗、薄荷、竹叶、生甘草、荆芥穗、淡豆豉、牛蒡子、芦根10味药物组成，其中金银花、连翘既有辛凉透邪、清热之功，又具芳香辟秽解毒之效；薄荷、牛蒡子辛凉，疏风清热而利咽喉。荆芥穗、淡豆豉辛温，助君药开皮毛而逐邪，芳香辟秽。竹叶可清上焦热；芦根可清热生津；桔梗可宣肺止咳。甘草既可调和诸药，护胃安中，又可合桔梗清利咽喉。

RSV感染常常导致免疫损伤和炎症的出现。在活化炎症因子的过程中，NALP3炎性体有不可或缺的作用。NALP3炎性体是NOD样受体蛋白家族成员，是体内免疫系统对病原体的感受器，可识别病原体并产生相应的免疫应答反应。NALP3炎性体由NOD样受体家族成员3、ASC、以及半胱天冬酶caspase-1组成。当配体与NALP3结合后促进炎症小体的形成，并对caspase-1进行自身激活，导致IL-1β和IL-18等各种炎性因子的成熟及分泌，引起各种免疫炎症反应[6]。

肺指数是指肺重占机体体质量的百分率，通常以肺指数值的大小表示肺炎性疾病病变的严重程度，用肺指数可以作为药物作用的检验指标，发挥定量的作用，客观的反应肺病变的程度。HE染色观察鼻黏膜组织上皮细胞受损程度、水肿程度以及嗜酸性粒细胞浸润能够间接表明银翘散的治疗效果。同时采用HE染色观测肺组织病理形态变化，观察肺组织肺泡形态、间质血管、水肿以及炎性细胞渗出情况可以间接判断银翘散的治疗效果。RSV感染能够导致炎症的发生，导致一些因子如细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、细胞因子、趋化因子和其他炎症介质等发挥宿主防御功能，启动抗病毒和炎症反应[7～10]，所以检测炎症因子可以间接反映银翘散的治疗效果。另外，研究表明[6]，NALP3炎症小体是细胞内负责免疫和炎症过程的蛋白复合物，其由NALP3、ASC及caspase-1组成，NALP3、ASC和caspase-1的表达和炎症因子的表达密切相关，肺组织NALP3、ASC和caspase-1表达水平可以作为银翘散疗效的间接指标。

采用银翘散治疗RSV感染小鼠可以降低肺指数，抑制NALP3、ASC和caspase-1的表达水平，从而抑制炎症小体NALP3的形成，降低IL-1β、TNF-α、IL-6的表达，显著减轻鼻黏膜上皮细胞受损情况、组织水肿以及鼻黏膜充血的程度，显著减少嗜酸性粒细胞浸润以及阻止肺泡间隔变薄，减轻间质血管扩张、充血、水肿，减少炎性细胞渗出。银翘散高、中剂量组的治疗效果和利巴韦林相似，强于银翘散低剂量组，所以建议采用高、中剂量银翘散进行RSV感染治疗。

本研究选择小鼠建立RSV感染模型，虽然技术成熟且应用广泛，但由于其缺乏临床症状的表达且为慢效应模型，加之小鼠并不是RSV感染的唯一宿主，炎症反应可能不显著，影响药物效果的观察，因此具有一定的局限性，在今后的研究中需寻求更理想、更稳定、更可靠的模型。中药具有成分复杂、副作用少、药源丰富、价格低廉且作用靶点多的特点，本研究重视病毒-机体-中药三者的关系，通过动物实验评价了银翘散对RSV感染所致呼吸系统炎症的改善作用，但关于该药的有效成分以及药理活性研究还有待考察。下一步课题组将应用现代技术手段深入研究银翘散抗RSV的主要活性成分，并通过临床实验进一步探讨银翘散抗RSV感染相关疾病的临床应用价值，为中药走向世界提供更为科学的理论依据。

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