朱 研，苗书魁，马文戈，李金娜，魏玉荣，汪 萍，魏 婕，米晓云，黄 炯

(1新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830011)

0 引 言

【研究意义】口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)被世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)列为法定上报的动物疫病，被我国农业部列为一类疫病[1]。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaⅠ共7个血清型，目前全球主要流行O型和A型FMD，其次为AsiaⅠ型和SAT2型，其中O型危害最为严重[2]。我国O型FMD主要流行3个拓扑型，为Cathay 拓扑型(古典中国型)、SEA拓扑型(东南亚拓扑型)和ME-SA拓扑型(中东-南亚拓扑型)。FMDV RNA约由8 500个核苷酸( nucleotides，nt)的无囊膜单股线状正链RNA组成，包括约1 300 nt的5’非编码区(5’untranslatedregion，5’UTR) 、约6.5 kb的1个大的开放阅读框(open reading frame，ORF) 、约90 nt的3’非编码区(3’untranslatedregion，3’UTR)及poly(A)组成[3]。在口蹄疫RNA基因组5’末端有一个特殊的小蛋白(VPg)，通过磷酸二酯键与尿嘧啶残基相连[4]。紧接着的5’UTR由1个约360 nt可折叠成茎环结构的S片段、1个约100-420 nt的聚胞嘧啶poly(C)片段和1个可形成许多二级结构的L片段及其它部分组成[5]，与启动多聚蛋白的翻译和病毒的复制有重要作用[6]。FMDV 5’端二级结构复杂，且有VPg(3B)蛋白、S片段、poly(C)等的存在，PCR时很难扩增出5’端的序列。试验用常规的PCR法扩增5’端的序列，为FMDV反向遗传学研究奠定基础。【前人研究进展】对于FMDV 5’端序列的扩增，研究者采用了不同的方法。有人先提取FMDV的RNA，再将其反转录成cDNA，最后扩增出5’端序列[7-9]。自1988年Frohman等报道cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)以来[10]，有学者[11-12]用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法成功扩增出FMDV的5’端序列。袁子文等[13]采用融合PCR得到FMDV 5’端序列；仝燕许等[14]以特异性引物反转录扩增获得FMDV 5’端的S片段和E片段，再通过融合PCR得到SE片段。……