赵英政，彭强，闫婷婷，张旭旭，翟晓楠，吴卫东，易宪文，徐光翠

(新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003)

Leprdb/db小鼠是研究肥胖、糖尿病等疾病常用的动物模型，其具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性[1]。与采用化学药物刺激建立的糖尿病模型相比，其发病与人2型糖尿病发病过程更为相似[2-3]。其发病机制是Leprdb/db小鼠的瘦素受体(leptin receptor，LR)基因胞内外显子区发生一个G-T的点突变，而造成瘦素受体变短失功能，不能将信号传至胞内[4]。由于纯合Leprdb/db小鼠不育，需通过杂合子交配进行繁殖。本研究采用TaqMan荧光定量探针技术，在常规PCR的基础上加入荧光标记探针来对杂合子Leprdb/+小鼠子代进行早期、快速基因分型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Leprdb/+动物购自Jackson实验室(北卡罗来纳大学易宪文教授赠送)，于IVC 动物房常规饲养【SYXK(豫) 2014-0005】，饲养期间给予SPF级啮齿类动物标准颗粒饲料(上海斯莱康提供)；室温20～22℃，明暗周期12 h/12 h，相对湿度60%～70%。按实验动物使用的3R原则给予人道关怀，自由摄食、进水。

1.1.2 试剂与仪器

TRIS购自北京索莱宝，NaOH购自天津德恩，HCL购自郑州派尼，EDTA购自Sigma公司，Hot Start Fluorescent PCR Core Kit 购自上海生工；荧光定量PCR仪(罗氏Light Cycler 480)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠DNA提取

将8周龄Leprdb/+小鼠按雌雄比为1∶1进行合笼。参考Truett GE的方法[5]，取待鉴定子代小鼠约0.5 mm鼠尾放入PCR管中，在提取DNA前一直低温保存。加入75 μL碱性溶液(25 mmol/L NaOH, 0.2 mmol/L EDTA，pH 12)；将PCR管放入金属恒温气浴器中，95℃，30 min，冷却至室温后加入75 μL中和液(40 mmol/L TRIS-HCl，pH 5)，震荡混匀；取2 μL混合液用于PCR反应。

1.2.2 探针和引物的设计

从NCBI SNP 数据库网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)获得Lepr基因序列及待测SNP 位点信息(基因序列号rs1801133)。用Premier 6.0软件设计常规PCR 扩增引物，采用Primer Express 3.0 设计TaqMan探针和引物。TaqMan探针分别采用FAM 和HEX 荧光素进行标记。样本为等位基因1(GG)纯合子时，PCR 扩增过程中仅能检测到FAM 荧光，为蓝色荧光；样本为等位基因2(TT)的纯合子时，PCR 扩增过程中仅能检测到HEX 荧光，为绿色荧光；样本为杂合子(GT)时，PCR 扩增过程中可同时检测到FAM 和HEX 两种荧光，表现为红色荧光。探针和引物由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物为5′ -ACC AAC TTC CCA ACA GTC CA-3′，下游引物为5′-TGA TGC CCT GAA AAT CAA GC-3′；野生型探针为HEX-5′-TTT GAT GGA GGGAAA CAA ACC TA-BHQ-X-3′，突变型探针为FAM-5′-TTT TGA TGG AGGTAA ACA AAC CTA A -BHQ-X-3′。

1.2.3 PCR反应体系及反应条件

使用TaqMan探针的20 μL反应体系中基因组DNA 2 μL (60 ng)，上下游引物各0.5 μL (0.25 μmol/L)，TaqMan探针0.8 μL (0.25 μmol/L)，2× Hotstart Fluo-PCR mix (ABI 公司) 10 μL，双蒸水6.2 μL。完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler 480 Software Setup (Roche 罗氏)荧光定量PCR仪进行反应。PCR 扩增循环条件：95℃ 4 min，其后的40 个循环为95℃ 15 s、40℃ 60 s， 40℃ 1 min 复性和延伸时收集荧光信号。PCR 扩增完成仪器终点读板读取数据，SDS 软件自动进行基因分型。

2 结果

2.1 Leprdb/+小鼠子代分型情况及基因频率Hardy-Weinberg平衡检验

共采集样本228例，采用TaqMan探针荧光定量PCR 技术终板读数结果见图1。结果在228份样品中Leprdb/db41例，基因型频率为0.1929；Leprdb/+123例，基因型频率为0.5395；Lepr+/+64例，基因型频率为0.2807。经HW (Hardy-Weinberg)平衡检验，计算χ2值为5.42，P值大于0.05，符合HW群体遗传平衡法则。G等位基因频率为0.5504，T等位基因频率为0.4496，经Hardy-Weinberg平衡检验，计算χ2值为2.32，P值大于0.05，符合HW群体遗传平衡法则。

2.2 TaqMan探针荧光定量PCR反应终点荧光检测结果

采用TaqMan 探针实时荧光分型法获得明确的分型结果。rs1801133 位点基因型检测结果如下：蓝色荧光样本为等位基因1(GG)纯合子；绿色荧光样本为等位基因2(TT)的纯合子，红色荧光样本为等位基因3(GT)杂合子(见图1)。

注：横坐标：FAM信号强度值；纵坐标：VIC信号强度值；蓝色点：Allele X 纯合子；绿色点：Allele Y 纯合子；红色点：杂合子。图1 TaqMan探针荧光定量PCR反应终点荧光散点图Note. Abscissa: FAM signal intensity value. Ordinate: VIC signal intensity value. Blue dot: Allele X homozygote. Green dot: Allele Y homozygote. Red dot: heterozygote.Fig.1 TaqMan fluorescence quantitative PCR reaction end point fluorescence scatter plot

2.3 TaqMan探针法Leprdb/+小鼠子代分型结果与小鼠肥胖表现型判断结果

比较Leprdb/db纯合子小鼠在2个月时表现为肥胖，可通过表现型进行判断基因型(见图2)。与TaqMan探针法分型Leprdb/d b小鼠结果进行比较分析，结果见表1。根据计算公式，灵敏度=真阳性数/(真阳性数 + 假阴性数)×100%，特异度=真阴性数/(真阴性数 + 假阳性数)×100%，Taqman探针法分型Leprdb/db小鼠灵敏度为97.56%，特异度为99.47%。

图2 2月龄Leprdb/db肥胖小鼠和Leprdb/+瘦小鼠肥胖表现型比较Fig.2 Comparison of obesity phenotype between a 2-month sold Leprdb/db obese mouse and Leprdb/+ lean mouse

肥胖ObesityTaqman探针法GenotypingusingTaqManprobe阳性(+)阴性(-)总计Total阳性(+)40141阴性(-)1186187总计Total41187228

3 讨论

培育和建立疾病动物模型是深入研究疾病发生发展机制的重要基础，通过对模型动物的研究有助于认识疾病发生发展规律以及进行干预效果评价[6]。瘦素受体缺陷的Leprdb/db小鼠模型具有糖脂代谢紊乱的特性，有助于研究肥胖、糖尿病等疾病，是国内外常用疾病动物模型之一。纯合Leprdb/db小鼠的瘦素受体基因发生了单位点的突变，因此，可借助与新发展的单核苷酸多态性(SNP)技术对其进行基因分型。

TaqMan探针荧光PCR技术是一种通过检测PCR 过程中及结束后产生的荧光信号，来区分等位基因类型的SNP 检测技术[7]。TaqMan技术进行基因分型的原理是在荧光探针的两端分别标记有不同的荧光基团和荧光淬灭基团，在反应进行过程中，探针特异的在两条引物之间的位置与模板特异性结合，不能在其他位置结合。如果探针完整，荧光基团所发出的荧光能量可以被荧光淬灭基团所吸收，仪器就不能检测到荧光信号。当探针和模板结合后，荧光基团游离出来，产生荧光信号而被仪器所检测到。不同的目的基因片段位点的碱基不同，所呈现的荧光也不一样。

本研究成功建立了对Lepr基因SNP 位点(rs1801133)的TaqMan探针荧光定量PCR 技术分型方法。PCR反应终点荧光散点图结果表明三种基因型区别明显，未见无法识别样本。经Hardy-Weinberg (HW)平衡检验和动物表现型比较分析表明，TaqMan探针荧光PCR 法用于Leprdb/db基因SNP 分型结果准确、可靠，具有较高的敏感度和特异度。此方法为培育Leprdb/db模型动物提供快速的方法和手段。传统对Leprdb/db模型动物野生型和突变型等位基因的分型方法主要是用聚合酶链反应限制性内切酶片段长度多态性分析 (RFLP)，该方法需先完成对靶基因的扩增和鉴定，耗时长，操作步骤复杂，不利于方法的标准化[8]。随着荧光定量PCR 仪的广泛应用，TaqMan探针荧光PCR 技术操作便捷，可短时间内完成大量的样品分析，并且成本低廉，满足SNP 大规模样本检测的需求。该技术结合相应的软件对产物进行分析，达到分析自动化，易于标准化。因此，该技术具有极为广泛的应用前景。

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