赵丽娟 ，张 洪 ，解静芳 ，张建华

（1.忻州师范学院生物系，山西忻州 034000；2.山西大学环境与资源学院，山西太原 030006；3.山西省分析科学研究院，山西太原 030006）

氯磺隆作为磺酰脲类除草剂的代表品种，在我国的玉米栽培中被广泛使用，但是施用过程中产生了诸多问题，其中最为突出的是农田土壤中的残留药害[1]。STORK[2]报道，氯磺隆在土壤中的残留可持续3～5 a，从施用到分解的过程中，氯磺隆降解至初始浓度的1%的时间需要33～63个月，并且仍然会对后续播种的敏感作物产生一定的药害。同时，我国北方地区由于缺水而导致的工业污水灌溉极为普遍，从而造成了土壤中重金属镉（Cd）积累。在土壤中，Cd对作物的毒害作用较为突出，因此，《土壤环境质量标准》规定，Cd的限定值比其他重金属（Hg，Pb，Cr，As）更加严格[3-5]。作物通过土壤吸收和污水灌溉之后，Cd浓度在组织中产生积累，作物生理表现为：植株矮化、根系发黑变短，甚至会出现分蘖受抑制，以致于作物的品质和产量都会下降[6]。目前，由于现代工业和农业生产的迅速发展，农田土壤体系中的单一污染几乎不存在，多种污染物共同作用于作物常有发生。

本试验通过对土壤中的氯磺隆单一污染及氯磺隆和镉的复合污染下，菠菜幼苗抗氧化酶活性和叶绿素含量的变化研究，旨在为土壤中2种污染物对波菜的联合毒性提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

菠菜（Spinacia oleracea L.）种子为日本翠玉大菠（山西大丰种业有限公司）。

1.2 试剂及仪器设备

谷胱甘肽-S-转移酶试剂盒（上海纪宁公司）；氯化镉（GR）（天津科密欧公司）；万分之一天平（AL104，METTLER TOLEDO公司）；光照培养箱（LI15，美国SHELLAB有限公司）；紫外分光光度计（UV2100，UNICO公司）；高速冷冻离心机（JXN-30，BACKMANCOULTER公司）。

1.3 方法

根据氯磺隆对菠菜生长的抑制率进行预试验，设置土壤中氯磺隆含量分别为0.000 1，0.000 3，0.001，0.003，0.005 mg/kg。根据文献研究，国内污灌区农田土壤中Cd浓度最高可达5.0 mg/kg[7-8]，因此，选取5.0 mg/kg作为土壤中Cd的添加量。毒理学试验设单一污染和复合污染2组，单一组只添加5个不同浓度的氯磺隆，复合组为Cd（5.0 mg/kg）＋5个不同浓度的氯磺隆。每组设空白对照，每个处理6次重复。

将500 g耕作层土与氯磺隆和Cd混合均匀，装入钵体种植菠菜。种子埋好，放入光照培养箱。保持12 h昼夜交替，相对湿度（RH）40%～60%；温度（20±2）℃；每日固定时间给菠菜浇水。当作物幼苗长出2片真叶时，每钵定植5株。菠菜种植至第40天，取各处理组的植株进行叶绿素含量、抗氧化物酶活性的测定。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 波菜的抗氧化酶活性的测定 取0.2 g菠菜样品，加入5 mL内含1%的聚乙烯吡咯烷酮、pH值为7.8的磷酸盐（PBS）溶液，0℃下进行研磨，设置离心机6 000 r/min，4℃离心10 min。取上清液，进行酶活性测定[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）采用氮蓝四唑法进行测定[10]。过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法进行测定[11]。过氧化氢酶（CAT）测定方法参考李合生[12]的《植物生理生化实验原理和技术》进行。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）采用上海纪宁公司生产的试剂盒进行测定。

1.4.2 丙二醛（MDA）和叶绿素含量的测定 取菠菜样品0.5 g，5 mL0.1%三氯乙酸冰浴研磨，7 000 r/min离心30 min，取2 mL上清液，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸，95℃水浴充分反应30 min，放置室温，10 000 r/min 离心 8 min。于 605，530，455 nm 测定吸光值。计算MDA含量[13]。

称取菠菜0.1 g，加入8 mL80%丙酮溶液研磨，7 000 r/min离心10 min。上清液在663，645 nm测定吸光值，推算总叶绿素的含量[14]。

1.5 数据分析

数据均取3次重复的平均值，采用标准差和T检验的方法分析不同处理之间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同处理对菠菜SOD活性的影响

细胞中O2-·主要由SOD进行清除，O2-·可由SOD催化转化为H2O2和O2，由此阻止生物膜脂质过氧化反应，从而对生物膜起到保护作用[15]。

图1结果显示，与对照相比，Cd单一污染对SOD酶活性不会产生显著影响。当土壤中氯磺隆含量超过0.003 mg/kg时，菠菜食用部分中的SOD活性才会显著增加（P＜0.05）；Cd与氯磺隆的复合污染与氯磺隆单一污染相近，同样为氯磺隆含量超过0.003 mg/kg时，SOD活性显著增强。2组试验结果表明，土壤中氯磺隆的含量对菠菜体内的SOD产生主导作用，Cd影响不显著。

2.2 不同处理对菠菜POD活性的影响

POD是植物体内所产生的一类氧化还原酶，能催化很多反应。在植物代谢中，由于各种生理还原底物不同而具有不同的功能，主要对H2O2的清除起关键作用[16]。

在氯磺隆的单一和复合污染处理组，菠菜POD随着氯磺隆含量的升高，活性显著增强（P＜0.05），当氯磺隆含量为0.000 3 mg/kg时，单一污染对菠菜POD酶活性与对照之间无显著差异，但是在加入Cd之后，菠菜处于二者的联合暴露，POD活性显著上升（P＜0.05）。表明2种污染物的联合作用对菠菜的生理产生更强的毒性，且二者呈现正相关效应（图 1）。

2.3 不同处理对菠菜CAT活性的影响

CAT可清除植物组织中H2O2，使之分解成O2和H2O，主要存在于植物过氧化物酶体内，是植物体内重要的酶促防御系统之一[10]。

由图2可知，氯磺隆单一暴露下，随着氯磺隆含量的增加，菠菜CAT活性显著增强（P＜0.05）。与对照相比，Cd单一暴露组CAT活性无显著性差异（P＞0.05）。在Cd和氯磺隆联合暴露下，CAT活性较氯磺隆单一暴露组增强更快，由此表明，二者的联合暴露会对CAT活性会产生刺激作用。

2.4 不同处理对GST活性的影响

GST可以催化还原型谷胱甘肽（GSH）与各种亲电子外源化合物发生结合反应，从而防止亲电子外源化合物进入生物体内产生有毒物质，从而达到解毒的作用，是植物体内重要的解毒酶。对各种有机污染物、农药、重金属可起到解毒的作用[17-18]。

氯磺隆单一污染、氯磺隆与Cd复合污染对菠菜中GST的影响相同，都呈现出随浓度增加GST先上升后下降的趋势（图2），可能是由于菠菜暴露在混合污染物中，在低浓度时，GST参与对外源毒物的解毒反应，因此，活性上升；但随着暴露含量的增加，其体内底物GSH被大量消耗，从而导致GST的活性迅速降低。

2.5 对菠菜中MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化的重要分解产物，其含量可以反映生物的抗性生理指标，进而间接地表达膜系统受到伤害的程度。从图3可以看出，菠菜在氯磺隆单独暴露下，土壤中农药浓度含量为0.000 3，0.001 mg/kg时，MDA含量显著上升，在0.005 mg/kg浓度时表现为含量显著下降，其总体趋势表现为随着氯磺隆含量浓度的增加呈先上升后下降的变化趋势。

复合污染处理组，菠菜的丙二醛含量在5.0＋0.003 mg/kg显著升高（P＜0.05），5.0＋0.005 mg/kg处理组显著下降（P＜0.05），其余处理组与对照相比，无显著性差异（图3）。在2种复合污染物的同时暴露下，其总体变化趋势为：随着氯磺隆浓度的增加，MDA的含量呈先上升后下降，但是下降的趋势要比氯磺隆单独暴露出现的浓度更低。其可能是由于低含量氯磺隆单一和联合暴露组，都尚未对菠菜细胞膜和细胞造成伤害；而当氯磺隆含量达到一定的阈值时，细胞膜被损伤，随即产生MDA的积累；之后呈下降趋势，则可能是因为抗氧化酶活性的增强，清除了过多的活性氧，从而保护细胞膜，使得MDA含量恢复到正常水平。

2.6 不同处理对菠菜叶绿素含量的影响

由图3可知，随着氯磺隆含量的增加，菠菜中叶绿素含量出现显著下降（P＜0.05）。与对照相比，氯磺隆含量达到0.005 mg/kg，菠菜的叶绿素含量下降到0.6 mg/g。

与空白相比，Cd诱导菠菜叶绿素含量显著下降（P＜0.05）。Cd造成菠菜叶绿素含量下降的原因可能是由于Cd离子会减少菠菜中叶绿体基粒、类囊体的数量，破坏叶绿体结构，从而致使叶绿素含量降低[19]。氯磺隆与Cd复合污染后，未加快菠菜叶绿素含量的下降，由此可见，复合污染物对作物叶绿素含量未产生协同作用。

3 结论与讨论

氯磺隆在单一污染和复合污染过程中均会诱导菠菜幼苗中SOD，CAT，POD活性显著升高。Cd的单一污染对菠菜幼苗POD，SOD，CAT和GST这4种抗氧化酶活性不产生显著影响；复合处理组与氯磺隆单一处理组和Cd单一处理组相比较，POD和CAT活性在复合处理组均显著加强，由此表明，Cd和氯磺隆复合对POD和CAT活性可产生刺激作用，这样可使植物清除体内过多的活性氧和H2O2，MDA含量与二者的变化趋势相同，也可对此进行印证。此外，GST活性在复合污染处理高浓度组显著下降，表明谷胱甘肽除了需要结合氯磺隆，还需结合重金属Cd，由于结合的底物较单一污染多，所以，酶活性下降较快。综合以上各种酶活性变化结果表明，当氯磺隆和Cd共同作用菠菜幼苗时会产生正协同效应。单一污染与复合污染都会降低菠菜幼苗中的叶绿素含量，但是2种处理间无显著性差异。

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