杨天睿，苗云波，张彤，段靳岚，朱滢，穆宁晖，余锦雯

缺血性心脏病严重威胁人类健康，且发病年龄呈现日益年轻化的趋势。心肌缺血重新恢复血流供应后，反而会造成心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面的进一步损害，甚至是不可逆损伤，继而出现严重的心律失常和心功能不全，严重者可导致死亡，即出现心肌缺血再灌注损伤［1］。缺血与再灌注时间是再灌注损伤的重要影响因素，了解其对缺血再灌注损伤的影响程度有着重要意义。本研究运用Langendorff离体心脏灌注系统建立实验树鼩心肌缺血再灌注模型，分别采用不同的停灌和再灌注时间进行干预，通过寻找组间心肌酶学及切片梗死面积的差异来源，分析缺血、再灌注时间及其交互作用对再灌注损伤的影响程度。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2015年9月—2017年5月，选取健康成年雄性滇西亚种实验树鼩60只，4～6个月龄，体质量120～150 g。实验动物由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供，动物许可证：滇发驯繁（92-29）号，合格证：SCXK（滇）K2015-0002。术前禁食过夜，自由饮水。本研究经云南省第一人民医院伦理委员会批准。

1.2 设备与器材 Langendorff离体心脏灌注系统（型号：PowerLab，生产商：ADInstruments）是研究小鼠、大鼠、豚鼠、树鼩等动物心脏的理想工具，该系统具有恒定流量或恒定压力两种模式，实现冠状动脉流量监控，同时温控控制精确恒定，可记录和分析各种心血管参数。

1.3 造模方法 实验树鼩水合氯醛（1 ml/只）腹腔麻醉，经腹腔肝素化（普通肝素1 000 U/只）抗凝。迅速开胸分离心脏，在主动脉根部快速将主动脉与其他血管一并剪断后取出心脏，立即放人0～4 ℃的K-H液中，排出残留血液，尽快将心脏移至Langendorff离体灌注系统装置上。主动脉逆行插管，同时放置球囊进入左心室后，用K-H液（pH为7.35～7.45）灌注，恒温（37 ℃）恒压（60 mm Hg，1 mm Hg=0.133 kPa），冠状动脉流量为6～12 ml/min，将肺动脉根部剪开以保证冠状动脉回流通畅，灌注液用量筒计时收集，以代表冠状动脉流量。

K-H液成分为NaCl 6.92 g/L、KCl 0.35 g/L、KH2PO41.2 ml/L、NaHCO32.1 g/L、MgSO40.296 g/L、 葡 萄 糖2 g/L、CaCl20.28 g/L、乙二胺四乙酸（EDTA） 0.187g/L。盐酸调节溶液酸碱度。灌注全程K-H液用95% O2和5% CO2混合气平衡。

在右心房及心尖部放置记录电极，连接多导电生理仪，全程记录灌注心脏的心电情况。采用随机数字表法，将实验树鼩分为5组，保证每组10只实验树鼩成功构建体外Langendorff心脏模型。A组稳定灌注30 min后取5只实验树鼩观察心肌梗死面积，其余模型继续灌注直至90min。B组稳定灌注30 min，停灌15 min，再灌注30 min。C组稳定灌注30 min，停灌15 min，再灌注60 min。D组稳定灌注30 min，停灌30 min，再灌注30 min。E组稳定灌注30 min，停灌30 min，再灌注60 min。B～E组分别在停灌后取5只实验树鼩观察心肌梗死面积，其余模型继续再灌注。造模成功标准：离体心脏在实验过程中心电稳定，未出现明显的心率减慢或持续室性心律失常，甚至心脏停搏的情况，持续灌注30 min后，心功能参数接近实验树鼩的生理状态，心率250～350 次 /min。

1.4 评价指标

1.4.1 心肌梗死面积 灌注结束，立即取下心脏，清洗，于-20 ℃冷冻2 h后，沿心脏冠状面以2 mm间隔切片。经2，3，5-氯化三苯基四唑（2，3，5-triphenyltrazoliumchloride，TTC）染色后进行数码照相，计算梗死面积。TTC与正常组织中的呼吸链酶反应而成红色，而缺血组织内呼吸链酶活性下降，染色组织呈灰白色。

1.4.2 心肌损伤标志物 心肌组织分割剪碎，与预冷的匀浆介质配比，研磨成10%的心肌均浆。取各组灌注液及心肌组织样本，采用微板法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）水平，试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0、GraphPad Prism 7.0进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，计量资料各组间的比较使用单因素方差分析，各因素效应与交互作用的分析采用双因素方差分析。以P＜0.05为差异为有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌梗死面积 A组、D组、E组停灌与再灌注后实验树鼩心肌梗死面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B组、C组再灌注后实验树鼩心肌梗死面积较停灌后增加，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。各组再灌注后心肌梗死面积比较，差异有统计学意义（F=11.017，P＜0.001）；其中，B～E组心肌梗死面积大于A组，D、E组心肌梗死面积大于B、C组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见图1，本文彩图详见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章）。

表1 各组停灌与再灌注后实验树鼩心肌梗死面积比较（±s，%）Table 1 Comparison of myocardial infarction area before and after perfusion in each group

表1 各组停灌与再灌注后实验树鼩心肌梗死面积比较（±s，%）Table 1 Comparison of myocardial infarction area before and after perfusion in each group

组别 停灌（n=5） 再灌注（n=5） t值 P值A组 4.95±0.92 6.35±3.62 -0.837 0.427 B组 10.28±1.86 15.09±0.74 -5.381 0.001 C组 10.51±2.79 20.26±6.89 -2.933 0.019 D组 27.99±6.79 31.49±11.01 -0.605 0.562 E组 25.60±6.26 32.42±9.49 -1.301 0.271

图1 各组心肌组织梗死面积（TTC染色）Figure 1 Myocardial infarction areas in each group

2.2 心肌损伤标志物

2.2.1 灌注液 各组灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中，B～E组灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平高于A组，C组CK-MB水平高于B组，D组CK-MB、LDH水平高于B、C组，E组ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C组，AST水平高于B～D组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表 2）。

2.2.2 心肌组织 各组心肌组织ALT、AST、CK-MB、LDH水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中，B～E组灌注液ALT、AST、CK-MB、LDH水平高于A组，D组ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C组，AST水平高于C组，E组ALT、CK-MB、LDH水平高于B、C组，AST水平高于B～D组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 停灌时间、再灌注时间及其交互作用对心肌损伤标志物水平的影响 停灌时间、再灌注时间对灌注液、心肌组织ALT水平的主效应显著（P＜0.05），两者交互作用不显著（P＞0.05）。

停灌时间、再灌注时间对灌注液、心肌组织AST水平的主效应显著（P＜0.05），两者对灌注液AST水平的交互作用显著（P＜0.05），对心肌组织AST水平的交互作用不显著（P＞0.05）。

停灌时间、再灌注时间对灌注液CK-MB水平的主效应显著（P＜0.05），两者交互作用显著（P＜0.05）。停灌时间对心肌组织CK-MB水平的主效应不显著（P＞0.05），再灌注时间对心肌组织CK-MB水平的主效应显著（P＜0.05），两者交互作用不显著（P＞0.05）。

停灌时间、再灌注时间对灌注液LDH水平的主效应显著（P＜0.05），两者交互作用不显著（P＞0.05）。停灌时间对心肌组织LDH水平的主效应不显著（P＞0.05），再灌注时间对心肌组织LDH水平的主效应显著（P＜0.05），两者交互作用不显著（P＞0.05，见表4）。

表2 各组灌注液心肌损伤标志物水平比较（±s，U/L）Table 2 Comparison of the levels of myocardial injury markers in perfusion fluid in each group

表2 各组灌注液心肌损伤标志物水平比较（±s，U/L）Table 2 Comparison of the levels of myocardial injury markers in perfusion fluid in each group

注：ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，CK-MB=肌酸激酶同工酶，LDH=乳酸脱氢酶；与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05；与D组比较，dP＜0.05

组别 只数 ALT AST CK-MB LDH A组 5 16.6±1.6 14.0±3.9 4.11±0.37 233.73±60.98 B 组 5 64.2±9.9a 59.5±10.2a 13.53±1.61a 372.27±41.91a C 组 5 65.7±13.7a 66.2±12.4a 9.88±3.33ab 348.51±41.31a D组 5 75.7±10.9a 68.0±8.5a 21.80±1.92abc 471.64±61.45abc E 组 5 81.1±11.7abc 86.8±8.9abcd 21.67±1.87abc 521.21±28.22abc F值 30.365 43.359 69.545 27.761 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 各组心肌组织心肌损伤标志物水平比较（±s，U/gprot）Table 3 Comparison of the levels of myocardial injury markers in myocardial tissues in each group

表3 各组心肌组织心肌损伤标志物水平比较（±s，U/gprot）Table 3 Comparison of the levels of myocardial injury markers in myocardial tissues in each group

注：与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05；与D组比较，dP＜0.05

组别 只数 ALT AST CK-MB LDH A 组 5 21.7±5.8 24.6±5.9 5.23±0.80 170.32±51.84 B 组 5 59.9±9.3a 68.6±4.9a 12.92±10.09a 313.19±48.17a C 组 5 68.1±9.2a 63.8±6.6a 13.11±2.38a 377.36±52.23a D 组 5 79.2±9.6abc 75.6±5.6ac 21.50±2.57abc 478.17±45.51abc E 组 5 78.7±4.4abc 84.9±9.3abcd 22.98±0.86abc 481.63±66.03abc F值 44.313 61.081 87.928 29.623 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

缺血性心脏病是临床常见疾病，心肌缺血是由于冠状动脉病变或痉挛，心肌供血供氧不足导致心肌出现代谢异常的病理状态，恢复血供是减轻缺血组织损伤的根本措施。目前，再灌注治疗仍然是临床治疗缺血性心脏病最有效的手段，主要通过药物溶栓、经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术使冠状动脉再通，重新恢复血供［2］，然而由此带来的缺血再灌注损伤严重影响临床治疗效果。研究发现，缺血心肌再灌注损伤是由多种触发物、媒介物效应器参与的复杂生物反应过程，涉及多种复杂细胞信号转导机制，并在多层次和诸多环节存在交互作用，造成心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面的进一步损害［3］。缺血再灌注损伤会导致心肌细胞水肿，结构受损、功能障碍，中性粒细胞趋集、黏附、释放炎性递质，介导其他炎性细胞攻击心肌细胞，最终引起心肌细胞坏死和凋亡，加剧缺血再灌注损伤。伴随心肌细胞损伤，线粒体崩解，细胞内酶大量释放入血液，血清及组织中ALT、AST、CK、LDH及其同工酶活性的增高是衡量心肌受损的重要指标［4］。同时，心肌梗死区域进一步扩大，梗死区内出血，合并存在心肌的坏死和凋亡现象。

表4 停灌时间、再灌注时间及其交互作用对心肌损伤标志物水平影响的双因素方差分析Table 4 Two-factor analysis of variance of the effects of suspension time and reperfusion time and their interaction on the levels of myocardial injury markers

实验树鼩具有生理解剖、神经发育和生化代谢等方面与人类相似的生物学特征，属于攀鼩目，其体型小、繁殖快、饲养和研究成本低，易实验操作，在生物医药研究方面是灵长类动物的补充［5］。Langendorff离体心脏灌注系统在离体灌注条件下避免神经体液因素的干扰，可直接观察到心肌缺血再灌注损伤作用［6］。基于以上特点，本研究运用Langendorff离体心脏灌注系统建立实验树鼩心肌缺血再灌注模型，通过对组内停灌和再灌注后心肌梗死面积比较发现，B组、C组再灌注后心肌梗死面积较停灌后增加。A组持续灌注，心肌组织切片无缺血梗死表现。B组、C组停灌时间为15 min，D组、E组停灌时间为30 min，说明停灌15 min时对实验树鼩心脏所造成的损伤已经发生，之后的再灌注加重了心肌缺血梗死的程度和范围，证实了心肌缺血再灌注损伤的发生；而缺血30 min对心脏所造成的损伤较为严重，心肌梗死后即使发生了再灌注损伤，梗死面积没有增加。在进行组间比较时发现各组心肌组织梗死面积，灌注液和心肌组织ALT、AST、CK-MB、LDH水平均存在差异，D组、E组再灌注后心肌梗死面积最大、心肌损伤标志物水平最高，心肌损伤表现最重。本研究进一步以停灌时间和再灌注时间为两因素进行双因素方差分析，探讨组间各指标差异来源。结果证实，停灌时间对灌注液、心肌组织的ALT、AST，以及对灌注液CK-MB、LDH的主效应显著，而再灌注时间对灌注液、心肌组织的ALT、AST、CK-MB、LDH主效应均显著，这一发现有利于进一步认识缺血再灌注损伤过程。

缺血再灌注损伤分为两个阶段，即缺血、再灌注阶段；一方面，由于缺血缺氧、酸中毒导致细胞膜通透性增加，细胞内超微结构损伤，另一方面，再灌注可造成细胞产生大量自由基、细胞内钙离子超载。有研究表明，缺血再灌注较单纯缺血使细胞内自由基、钙离子水平增加12～25倍，过多的自由基和钙离子可造成细胞的严重损伤［7］。由此，再灌注过程对损伤起着关键性作用，该阶段出现了严重能量代谢障碍，细胞内酸中毒，溶酶体膜不稳定，细胞蛋白合成与分解失衡，影响生物合成修复过程，成为不可逆变化。因此，临床工作中应积极关注不同的再灌注时间对急性心肌梗死患者预后的影响，开展早期再灌注治疗，但最佳再灌注时间尚需要进一步大样本研究证实。

综上所述，缺血时间和再灌注时间是影响心肌缺血再灌注损伤程度的关键因素，其中以再灌注时间更为重要。临床应积极关注缺血时间与再灌注时间，采取有效措施防止再灌注损伤的产生或减轻其损伤程度。本研究在实验树鼩心肌缺血再灌注模型中探讨了停灌时间和再灌注时间对心肌缺血再灌注损伤的影响，为防止缺血再灌注损伤的发生或减轻其损伤程度提供了重要依据，但本研究样本量相对较小，尚需大样本的动物实验进一步验证。

作者贡献：杨天睿、苗云波进行文章的构思与设计，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；杨天睿进行研究的实施与可行性分析、撰写论文；张彤、穆宁晖进行数据收集；杨天睿、穆宁晖、余锦雯进行数据整理；杨天睿、段靳岚进行统计学处理；杨天睿、张彤进行结果的分析与解释；杨天睿、朱滢进行论文的修订。

本文无利益冲突。

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