冉伟，张瑾，张新，蔺松波, 孙晓玲*



茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

冉伟1,2，张瑾1,2，张新1,2，蔺松波1,2, 孙晓玲1,2*

1. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008； 2. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶，测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明，与对照相比，茶尺蠖幼虫为害后3、6、12 h显著诱导了基因的相对表达水平，且在为害后3 h和12 h达到了极显著差异。基因在茶尺蠖为害后6 h和12 h，与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24 h显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高，而茶尺蠖为害后48 h仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照；儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24 h和48 h均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。

茶尺蠖；取食；儿茶素；诱导；茶树

茶树是我国重要的木本经济作物之一，富含茶多酚、咖啡碱和类黄酮类衍生化合物。儿茶素类是茶多酚的重要组成部分，是类黄酮衍生化合物的次生代谢产物，其含量约占鲜叶茶多酚总量的80%[1]。大量研究结果表明，茶多酚类物质具有显著的抑菌效果[2-5]。例如，Aditi等[5]研究了儿茶素类化合物对李斯特菌（）、铜绿假单胞菌（）、蜡状芽孢杆菌（）、金黄色葡萄球菌（）和大肠杆菌（）等病原菌菌丝生长的抑制作用，结果发现表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素（EGC）对上述病原菌均具有较好的抑菌效果。Wang等[6]发现，EGCG和儿茶素（C）对于茶树炭疽病病原菌（）的生长具有显著抑制效果。尽管很多研究结果证实，多酚类化合物在植物抗虫防御方面具有重要作用[7-8]，但是，关于茶树多酚类化合物抗虫功能的研究仅见少量报道，并且都集中于总茶多酚的抗虫方面[9-12]。目前，茶树多酚类化合物中具体哪种成分发挥了抗虫作用则尚不明晰。

茶尺蠖（Prout）广泛分布于我国各个茶区，是茶园中发生普遍且为害严重的食叶性害虫种类之一，是当前制约我国茶叶安全生产的重要因素。茉莉酸和乙烯信号转导途径与植物次级代谢产物的合成密切相关，研究发现这两条途径可被茶尺蠖幼虫取食所激活[13-14]。业已证明，茶尺蠖幼虫取食可诱导茶树释放大量挥发性化合物，这些挥发物可被天敌、害虫及邻近植物所识别，从而在害虫和天敌种群调控以及诱导邻近植株防御反应中发挥作用[15-17]。然而，有关茶尺蠖幼虫取食诱导茶树产生的有毒代谢物质或防御蛋白等方面的研究尚鲜见报道，尤其是具有广泛抗菌作用的儿茶素类化合物是否可被茶尺蠖幼虫取食所诱导则尚未见报道。鉴于此，本文拟通过比较健康茶苗与茶尺蠖幼虫为害茶苗叶片中儿茶素合成途径中无色花色素还原酶基因（，登录号：AY169404）和花青素还原酶基因（，登录号：AY641729）转录水平的表达量差异，以及不同处理茶树叶片中儿茶素类组分的含量差异，确定茶尺蠖幼虫为害对茶树儿茶素代谢途径的影响，以期为从茶尺蠖幼虫为害诱导的儿茶素类化合物中筛选出具有抗虫作用的功能物质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试茶苗

供试茶苗为3年生龙井43扦插苗，于(25±2)℃温室中培养，光周期为12 L︰12 D，相对湿度60%~70%，每4个月施1次有机肥。选择长势良好、无病虫害茶苗用于实验。

1.2 供试茶尺蠖

茶尺蠖幼虫饲养于智能型人工气候室，温度(25±2)℃，相对湿度60%~80%，光周期为14 L︰10 D，饲以新鲜茶树叶片。室内饲养一代后的3龄幼虫，饥饿3 h后用于茶苗处理。

1.3 茶苗处理

在(25±2)℃，相对湿度60%~80%，光周期为14 L︰10 D的条件下进行茶苗处理。将2头3龄茶尺蠖幼虫接种于茶树新梢芽下第二叶，套以透气网袋防止逃逸；仅套网袋不接虫的叶片作为对照。处理3、6、12 h后取芽下第二叶用于基因表达量分析。处理24、48 h后的芽下第二叶用于儿茶素含量的测定。每个处理6个重复。

1.4 基因表达量分析

采用TIANGEN试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行总RNA提取和反转录，具体步骤按照产品说明进行操作。以为内参基因，引物序列见表1。定量检测方法参照SYBR Premix ExTaq试剂盒（TAKARA，宝日医生物技术有限公司，北京）的操作步骤，采用20 µL体系于LightCycler96实时荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达水平。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。每个样品重复3次，反应结束后收集CT值进行分析。

1.5 儿茶素类含量测定

儿茶素类含量分析采用高效液相法[18]。准确称取0.1 g茶粉（液氮下研磨），加入1 mL 80%甲醇水溶液，震荡10 min（1 200 r·min-1），然后超声5 min（100 Hz，25℃），再震荡5 min后，离心30 min（–4℃，12 000 r·min-1），取上清液过0.22 µm滤膜，所得滤液用于分析。

1.6 数据分析

对照与处理之间和相对表达量及儿茶素组分含量的差异显著性均采用独立样本检验进行分析。统计分析软件采用SPSS18.0，在Windows 10操作系统下进行。

表1 qRT-PCR引物

注：与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，下同。Compare with CK, *P<0.05，**P<0.01. The same as follow.

2 结果分析

2.1 幼虫为害诱导CsLAR和CsANR的表达水平比较

茶尺蠖幼虫为害可显著诱导和在转录水平上的表达量。其中，的相对表达量在为害后3、6、12 h分别比对照提高2.77、3.18和3.13倍，且为害后3 h、6 h和12 h与对照相比具有显著性差异，在3 h和12 h达到了极显著差异；的相对表达量在为害后3、6 h和12 h分别比对照提高2.30、2.16和3.67倍，且为害后6 h和12 h与对照相比具有显著性差异。

2.2 幼虫为害诱导茶树叶片儿茶素类化合物的积累

茶尺蠖幼虫为害显著诱导茶树叶片没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）、表儿茶素（EC）、EGCG和ECG含量的升高，但是C、EGC和没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）的含量不受茶尺蠖幼虫为害所诱导。其中，GA、GC、EC、EGCG和ECG含量在为害后24 h即达到显著差异，而为害后48 h仅有GA和GC的含量显著高于对照（图2）。

图2 茶尺蠖幼虫为害对茶树儿茶素类化合物含量的影响

3 讨论

植物在与植食性昆虫的长期协同进化过程中，形成了一套有效的防御体系。在这一防御体系中，包含了植物组成抗性（Constitutive resistance）和诱导抗性（Induced resistance）两个方面。植物被植食性昆虫为害诱导后，通过积累有毒代谢物或防御蛋白对害虫进行直接防御，也可通过释放虫害诱导挥发物引诱植食性昆虫的天敌前来捕食或寄生而进行间接防御[19-21]。植物多酚类能被植食性昆虫取食所诱导，并参与到植物的抗虫防御中[8, 22-23]。例如，抗蚜虫小麦叶片总酚和邻二羟基苯酚的含量显著高于感虫品种，并且抗虫品种在蚜虫为害后更早和更强地诱导了查耳酮合成酶的活性和叶片多酚含量[8, 23]；棉花多酚含量与棉铃虫抗性也呈现正相关，且随棉酚剂量增加，棉铃虫幼虫死亡率增加、幼虫历期延长、蛹重逐渐减少、成虫产卵量降低[24]。儿茶素类是茶树中重要的酚类化合物，并对多种病原菌具有抑制生长的作用[5-6]。和是茶树类黄酮代谢途径的关键控制基因，无色花色素可以被转化为C、GC，被转化为EC和EGC[25]。本研究发现茶尺蠖幼虫为害后3、6、12 h可诱导相对表达水平的显著升高，且在3 h和12 h达到极显著差异，而的表达量在茶尺蠖为害后6 h和12 h与对照具有显著差异。根据上述结果，GC在茶尺蠖幼虫为害后24 h和48 h均显著高于对照，而C却始终与对照无显著差异，我们推测茶尺蠖幼虫为害诱导表达的仅使GC的含量显著积累，却并不影响C的含量。而ECG和EGCG在茶尺蠖幼虫为害后24 h被显著诱导，EC和EGC分别作为ECG和EGCG合成的前体物质，可能更早被的上调诱导合成，但新合成的EC和EGC又马上与1--没食子酰基-β-葡萄糖（βG）发生酯化反应生成了EGCG和ECG，并进一步参与到其他反应中，所以在茶尺蠖幼虫为害后48 h EGCG和ECG的含量与对照无显著差异。综上，茶尺蠖幼虫为害影响了茶树儿茶素代谢途径（图3）。

图3 茶尺蠖幼虫为害对儿茶素代谢途径的影响

众所周知，多酚氧化酶（PPO）在植物抵御病原菌侵染和植食性昆虫取食中发挥重要作用[26-29]，并且喷施茉莉酸甲酯和机械损伤都能显著诱导植物叶片中PPO的活性[30-33]。前期研究发现，茶树叶片PPO对茶尺蠖具有直接防御作用，能显著抑制茶尺蠖的生长发育[34]。有趣的是，茶尺蠖幼虫为害茶树叶片却显著降低了茶树叶片PPO的活性，而儿茶素类作为多酚氧化酶的底物，在茶尺蠖幼虫为害叶片中的含量却显著升高。并且酯型儿茶素类在茶尺蠖幼虫为害后24 h的叶片中显著高于对照，而为害后48 h的叶片中与对照却无显著差异，酯型儿茶素含量的这种变化是否与PPO活性降低具有相关性值得进一步研究。

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Infestation ofAffects the Catechin Metabolism in Tea Plants

RAN Wei1, 2, ZHANG Jin1, 2, ZHANG Xin1, 2, LIN Songbo1,2, SUN Xiaoling1, 2*

1. Institute of Tea Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

In this study, the effect of feeding byon the catechin pathway of tea plant was analyzed. The transcriptional levels of catechin-related genes and the contents of individual catechins in the infested or intact leaves were measured. The transcriptional level ofin the infested leaves was significantly higher than that in the intact leaves 3, 6 h and 12 h after infestation. Meanwhile, the infestation ofalso significantly induced the expression level ofafter 6 h and 12 h. The contents of gallic acid, gallocatechin, epicatechin, epigallocatechin gallate and epicatechin gallate were significantly induced 24 h after infestation. Moreover, the contents of gallic acid and gallocatechin were also significantly induced 48 h after infestation. However, the infestation ofdidn’t induce the increases of catechin, epigallocatechin and gallocatechin gallate. In a word, the infestation ofaffected catechin metabolism in tea plant.

, infestation, catechins, induced,

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2018)02-133-07

2017-12-18

2018-01-16

公益性行业（农业）科研专项经费（201403030）、国家自然科学基金（31471784、31272053）、浙江省“151”人才工程资助项目

冉伟，男，硕士研究生，主要从事茶树害虫互作方面的研究。

xlsun1974@163.com