王昕凝，孙雪峰，祖 强，卢锦山，黄 银，董 隽解放军总医院 泌尿外科，北京 0085；解放军总医院 肾病科，北京 0085；国家蛋白质科学中心(北京)数据科学课题组，北京 006

尿液是血液经过肾小球滤过及肾小管和集合管重吸收、分泌后产生的一种体液，其组成成分与肾生理及病理变化密切相关，也与机体整体代谢状态相关[1]。因此，肾移植受者尿液蛋白组分变化可以反映移植肾生理状态[2]。本研究的目的是运用定量蛋白质组学的方法检测移植肾正常受者及其相应供者的尿液蛋白质组差异，探讨功能正常的移植肾与健康肾是否存在差异。

对象和方法

1 研究对象 研究纳入了5对于2010 - 2014年在解放军总医院行肾移植术后3年以上的肾移植受者及其相应供者，供受者关系均为父母-子女关系。纳入标准：1)活体供肾，供受者均无明显全身或泌尿系统疾病；2)受者接受肾移植术后3年以上；3)受者未发生明确的慢性或急性排异反应。所有肾移植受者均采取三联免疫抑制治疗方案：泼尼松+麦考酚吗乙酯+他克莫司。所有供受者均于解放军总医院行尿常规、血常规、肝肾功能、B超等相关检查以排除全身或泌尿系统疾病。

2 标本收集及处理 收集10例受试者晨尿。取1 ml尿液加入2 ml超速离心管中，室温下2 000×g离心75 min，弃去上清；向离心管中加入50μl悬浮缓冲液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L蔗糖，pH 8.5)，室温放置15 min，之后加入2.5μl 1 mmol/L二硫苏糖醇，混匀65℃加热30 min；向离心管中加入200μl清洗缓冲液(10 mmol/L TEA，100 mmol/L NaCl，pH 7.4)，2 000×g离心30 min，弃去上清，向弃去上清的离心管内加入30μl消化缓冲液(50 mmol/L NH4HCO3，pH 8.5)， 之 后加 入 500 ng测序级胰酶(Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega)，混匀后在37℃孵育4 h消化蛋白；所得肽样品用于后续的质谱分析。

3 液相质谱分析 消化后所得肽样品用20 μl的上样缓冲液(5%甲醇，0.1%甲酸)溶解，然后取5μl上样，利用ThermoScientific的纳升级液相色谱串联高分辨质谱系统(nLC-Easy1000-Q Exactive-HF)进行数据采集。所得质谱数据利用Mascot2.3搜索引擎Proteome Discoverer V2.0进行肽序列数据库搜索分析。所用数据库为美国生物技术信息国家中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的人类蛋白质参考序列数据库。并利用DAVID对分析得到的差异蛋白列表进行GO富集分析，P＜0.05即表示差异蛋白在该GO条目中出现了富集。采用IPA通路数据库对差异蛋白列表进行生物通路分析，P＜0.05即表示差异蛋白在该通路条目中出现了富集。

结 果

1 供受者一般情况 所有供受者均接受供肾切取术及肾移植术3年以上，且均为父母供肾-子女受肾关系，至随访时无明显全身或泌尿系统疾病。供受者一般情况见表1。

2 尿蛋白质组差异蛋白 我们在所有尿样本中共检测出465个肽段≥1的特异蛋白，有12个蛋白在每对供受者中均存在差异。在肾移植受者尿液中高表达的蛋白有8个，分别为二磷酸腺苷核糖基转移酶3、碳酸酐酶4、视黄醇结合蛋白4、基底细胞黏附分子、过氧化物酶6、乳酸脱氢酶B、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3和丝氨酸蛋白酶抑制剂A1。肾移植受者尿液中低表达的蛋白有4个：细胞液泡蛋白质分选因子4B、囊泡运输体1、Bro1包涵域蛋白及三肽氨基肽酶1。见表2。

3 差异蛋白GO功能注释 我们对差异蛋白进行了GO注释分析。细胞组分注释主要为细胞外分泌体、细胞外环境等。生理过程注释主要包括急性期反应、ESCRTⅢ复合体解聚、病毒生命周期等。分子功能注释主要为蛋白结合作用。见表3。

4 差异蛋白参与通路分析 我们使用IPA通路数据库对差异蛋白进行生物通路分析，差异蛋白主要参与的生物学通路包括急性期反应信号传导、动脉粥样硬化信号传导、三酰甘油降解等涉及免疫反应、脂质代谢的生物学通路。见表4。

表1 供受者一般情况Tab. 1 Characteristics of donors and recipients

表2 受者与供者尿蛋白质组间的差异蛋白Tab. 2 Distinct proteins between urine proteome of donors and recipients

表3 差异蛋白GO功能学注释Tab. 3 GO terms of distinct proteins

表4 差异蛋白生物通路分析Tab. 4 Pathways of distinct proteins

讨 论

尿蛋白质组学技术的成熟可使我们对移植肾免疫反应的病理生理学机制进行探索[3-4]，同时也为寻找无创排异反应特异性标记物提供了良好的研究方法[5]。本研究中，我们对5对移植肾功能正常的受者及其相应供者进行尿蛋白质组检测及生物学功能分析。

我们在供受者尿液中共发现了12个含量差异较大的蛋白，并对这些差异蛋白进行了GO注释分析和生物学通路分析。GO注释分析提示差异蛋白主要存在于细胞外液或血小板颗粒内。尿液所含蛋白中，定位于细胞外的蛋白主要来源于泌尿系统对血浆的过滤、分泌作用，表达含量相对较稳定；而定位于细胞内的蛋白质则主要由于肾、尿道、膀胱组织表皮脱落细胞衰老或者损伤导致细胞破损而释放入尿液，这些蛋白相对而言表达不稳定[6]。另外差异蛋白主要为结合蛋白，提示差异蛋白可能参与信号通路的传导。生理过程分析提示，相关差异蛋白的生物学功能主要为物质转运、复合体组件及参与免疫反应。而差异蛋白参与通路主要为免疫反应、脂质代谢等生物学通路。供受者尿液中蛋白质含量差异可能与移植肾在受者体内的生理变化有关。

国内外有报道差异蛋白SERPINA3及其家族内的其他蛋白(SERPINA1等)在急性排异反应患者的体内表达异常[7-13]。SERPINA家族蛋白是一种胰蛋白酶抑制剂，可以作用于包括丝氨酸蛋白酶在内的多种靶点，而SERPINA3在体内的表达异常与机体免疫系统对移植物的排异反应有关，抑制组织蛋白G的活性[14-15]，而组织蛋白酶G则是一种与排异反应相关的粒细胞蛋白酶[16]。相比功能正常的肾移植受者，发生急性排异反应受者尿液中SERPINA3明显增高。贾雄飞等[17]对发生急性排异反应的肾移植受者行尿蛋白质组检测时发现，SERPINA3前体在急性排异反应受者尿液中明显升高，且随免疫抑制剂的应用而逐渐降低，机制为控制CD8+T细胞的过度活化而增加了SERPINA3的合成及释放。O'Riordan等[7]对急性排异受者及稳定受者进行了肾组织活检后发现，二者肾组织中总SERPINA3含量并无明显差异，考虑SERPINA3在尿液中的升高可能是其与靶向蛋白酶相互作用的结果，提示其靶向蛋白酶在急性排异反应受者体内活性升高；而Ziegler等[18]对肾移植术后急性排异反应发生及治疗后的血浆组分研究中发现，SERPINA3的C端片段对检测排异反应有着100%的敏感性及94%的特异性。本研究中我们所纳入的移植肾正常的受者均无临床排异反应发生，但SERPINA3及SERPINA1在受者尿液中含量较供者升高，提示相关靶向蛋白活性在移植肾正常的受者体内与健康肾有差异。

综上所述，我们发现肾移植术后受者与供者尿蛋白质组存在差异，此差异主要与能量代谢、物质转运及免疫反应等生理功能有关。

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