齐诗蕊，陈 俊，李 环，栾 哲，李丛勇，王 聪，袁 静，孙 刚,解放军总医院 消化内科，北京 0085；军事医学科学院疾病预防控制所，北京 0007；解放军总医院海南分院 消化内科，海南三亚 57000

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种感染率极高的细菌，我国人群感染率高达50%左右[1]，其感染与很多胃肠道疾病甚至是胃肠外疾病密切相关[2-4]。因此检测幽门螺杆菌的手段也在迅速发展[5-8]，包括侵入性检测和非侵入性检测。侵入性检测指依靠胃镜取材用以检测该菌的方法，目前临床应用最广的为快速尿素酶试验和病理组织学检查，但这两种方法均会对胃黏膜造成损伤，且不适用于凝血功能差或服用抗凝药物的患者。目前临床常用的非侵入性检测方法有血清学检测、粪便抗原检测(Helicobacter pylori stool antigen，HpSA)、尿素呼气试验 (urea breath test，UBT)等。血清学检测无法分辨患者是否存在现症感染，根除幽门螺杆菌后很长时间内抗体仍会存在；HpSA方法简便易行，适用范围广，但其敏感性和特异性相对较低；UBT被认为是目前诊断幽门螺杆菌的最佳方法，但对于很多拟接受胃镜检查的患者，再行UBT则增加了时间和经济成本。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)是一种新型核酸扩增技术[9]，近年来广泛应用于快速检测流行细菌或病毒[10-13]。本研究拟基于LAMP技术，建立一种胃镜下同步、无创、快速检测幽门螺杆菌的方法，并对其准确性、灵敏度及特异度进行评价。

材料和方法

1 主要试剂与仪器 LAMP反应试剂盒(日本荣研株式会社)；细菌DNA提取试剂盒(Promega)；钙黄绿素(Regal Biotechnology)；LAMP反应引物(上海生工生物工程公司合成)；LAMP浊度仪(荣研化学株式会社)；紫外分光光度计(Nano Drop)；离心机5417R(Eppendorf)；恒温金属浴(杭州博日科技公司)。

2 菌株信息 本实验所用验证菌株均来自军事医学科学院疾病预防控制所传染病控制中心菌种库，分别为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)，B型链球菌(group B streptococcus)，停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)，产酸肠杆菌 (acid-producing Enterobacter)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，福氏志贺菌(Shigella flexneri)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，大 肠 埃希 菌 (Escherichia coli)，致病性大肠埃希菌(pathogenic Escherichia coli)，肠黏附性大肠埃希菌(enteroadherent Escherichia coli)，肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)，金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)，霍乱弧菌O139群(Vibrio cholerae O139)，布氏不动杆菌(Brinell acinetobacter)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)，炭疽杆菌(Bacillus anthraci)，结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，阿伯丁沙门菌(Aberdeen Salmonella)，百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。

3 幽门螺杆菌DNA模板的提取与浓度测定 选用Promega Wizard® Genomic DNA Purification KitA1125提取幽门螺杆菌的基因组DNA，具体提取方法详见Promega DNA提取试剂盒说明书。

表1 幽门螺杆菌LAMP引物序列Tab. 1 Primers of UreB gene of H. pylori

4 LAMP法检测幽门螺杆菌的引物设计 在NCBI中检索已知幽门螺杆菌特异性基因UreB基因序列，Genebank登录号：AY714224.1。利用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对这段序列进行同源比对，发现UreB基因的特异性较好。根据该段保守序列，用Primer design V4软件设计出5套LAMP引物(代号分别为HPUB1、HPUB2、HPUB3、HPUB4、HPUB5)引物序列见表1。

5 LAMP反应体系的建立 反应体系(25μl)：待测样品基因组DNA 2μl，20 mmol/L Tris·HCl(pH 8.8)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，0.1% 吐温 20(Tween 20)，0.8 mol/L 甜菜碱 (betaine)，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTP和每8U Bst DNA聚合酶。引物加入量：40 pmol FIP和BIP所示引物，20 pmol LF和LB所示引物，5 pmol F3和B3所示引物。如通过裸眼颜色判读，则每反应体系需添加1μl荧光染料(FD)。

6 LAMP结果判读 实时浊度仪监测1 h内浊度上升至额定值表明样品中含有幽门螺杆菌；裸眼显色法在反应液中添加荧光染料，观察反应前后颜色变化，绿色代表样品中含有幽门螺杆菌，橙色代表样品中不含有幽门螺杆菌。

7 临床胃液样本验证 随机选取2016年4月-2016年8月解放军总医院门诊同时接受胃镜检查和13C呼气试验检查的患者80例，其中男44例，女36例，年龄(50.6±12.3)岁。近1个月内均未服用抗生素、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂等可能影响H.pylori检测结果的药物。所有患者接受胃镜检查时均留取10 ml胃液标本(用20 ml注射器通过活检孔道抽取)用于LAMP法检测。以13C呼气试验检查阳性为诊断标准。验证LAMP法检测胃液中幽门螺杆菌的灵敏度及特异度。

8 统计学方法 统计学处理应用SPSS17.0统计分析软件，计量资料以-x±s表示，计数资料以频数和百分数表示，计算不同检测方法的准确度、特异度、灵敏度，检测方法间的差异比较采用McNemar检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 LAMP引物的筛选 以幽门螺杆菌的全基因组DNA提取液为模板，分别以HPUB1、HPUB2、HPUB3、HPUB4、HPUB5为引物，浊度监测60 min显示结果，见图1。相同温度和反应体系下5种引物LAMP反应发生速度及扩增效率由高到低依次为 HPUB3、HPUB1、HPUB4、HPUB5和 HPUB2。按照以上顺序对引物逐一进行特异性检验。

2 LAMP引物特异性检验 分别以菌株信息所述菌株基因组DNA为模板，以ddH2O为阴性对照，对HPUB3进行特异性检验。实时浊度仪和裸眼显色结果均发现该引物仅可引起幽门螺杆菌发生扩增反应而不能使其他29种菌株(详见菌株信息)及ddH2O发生反应(图2)。用HPUB3作为反应引物，LAMP法检测幽门螺杆菌特异性好。

图1 幽门螺杆菌LAMP引物的筛选Fig. 1 Optimal primers of H. pylori

图2 幽门螺杆菌LAMP引物的特异性检测 (31：幽门螺杆菌；30：阴性对照；1 ～ 29：其他菌种)Fig. 2 Specificity test of LAMP primers of H. pylori (31: H.pylor;30: negative control; 1 -29: other bacteria)

3 LAMP法最佳温度筛选 以幽门螺杆菌DNA提取液为模板，以HPUB3为引物，分别在58 ～ 65℃进行反应。浊度监测60 min显示结果(图3)。当反应温度为64℃时最先发生反应且扩增效率最高，设定为最佳温度。

4 LAMP法最低检测限 用HPUB3组合作为引物，以幽门螺杆菌DNA提取液作为模板，使用前经Nano分光光度计测得该模板浓度为46.3 ng/μl，用去离子水进行10倍梯度稀释，浓度从2.61×107拷贝 /μl (46.3 ng/μl)到 2.61 拷贝 /μl (0.004 63 pg/μl)。将10倍梯度稀释的幽门螺杆菌总DNA用于LAMP反应，检测结果如图4所示，无论是浊度仪检测还是裸眼显色法检测均得到相同的结果，LAMP最低检测浓度为2.61×103拷贝/μl (4.63 pg/μl)。5 临床胃液样本验证 以13C呼气试验为金标准验证LAMP法检测胃液中幽门螺杆菌的灵敏度为97.06%，特异度为100%，两种检测方法的差异无统计学意义(P＞0.05)(如表2)。

图3 幽门螺杆菌LAMP最佳温度筛选Fig. 3 Optimal temperature for reaction

图4 幽门螺杆菌的最低检测限结果Fig. 4 Minimum detectable limit of H. pylori

表2 LAMP法与13C呼气的诊断一致性评价Tab. 2 Diagnostic evaluation of LAMP using 13C urea breath test as gold standard

讨 论

2015年全球约44亿人感染幽门螺杆菌，不同国家和地区的感染率不同，其中感染率最高的是非洲，最低的是北美洲和大洋洲，亚洲人群幽门螺杆菌感染率在50%左右，农村地区感染率高于城市[1]。幽门螺杆菌感染被认为是人类慢性胃炎[14]、胃十二指肠溃疡[15]、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤[16]及胃癌[17-18]的重要致病因素。

LAMP法作为一种新兴分子生物学方法，因其高效、快速、简便的特点已应用于多种细菌及病毒的检测[19-20]。常用于检测幽门螺杆菌的标本包括胃黏膜组织、血液、粪便等，本研究中创新性地选取了胃液标本用于LAMP检测。本方法不会造成胃黏膜的损伤，这就使接受胃镜检查而无需活检或者具有活检禁忌证的患者可同步接受无创幽门螺杆菌检测，降低出血等并发症风险；另外，本研究中LAMP反应均在60 min内完成，患者在取胃镜报告的同时即可得到检测结果，为实现临床胃镜下同步、无创、快速检测幽门螺杆菌奠定了基础。

本研究以UreB基因为靶序列设计了5套幽门螺杆菌特异性LAMP引物，基于实时浊度仪与裸眼显色两种结果判定方式筛选出特异性及扩增效率高的一套引物组合，并收集临床样本，对该引物组合进行验证。结果显示，LAMP法检测幽门螺杆菌的灵敏度及特异度均较高，与13C呼气试验无统计学差异。

综上，本研究中用LAMP法检测胃液样本中的幽门螺杆菌可实现胃镜下无创检查，尤其适用于胃镜检查中无需活检或具有活检禁忌证的患者。然而，本研究中选取的临床样本数量较少，该方法应用于临床的可行性仍需更多的研究来证实。

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