史苗苗，李丹，闫溢哲，刘延奇

(郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州，450002)

淀粉主要由直链淀粉和高度支化的支链淀粉构成，线性直链淀粉的结构通过α-(1→4)糖苷键形成，支链淀粉分子结构由α-(1→4)糖苷键形成主键，α-(1→6)糖苷键形成分支[1-2]。根据X-射线衍射图谱，可将淀粉分为A型，B型，C型和V型。A型在15°、17°、18°、23°等处呈现明显的衍射峰；B型在5.6°、17°、24°处有明显的衍射峰；C型有天然的C型和由A型或B型转化而得到，衍射峰包括了A型与B型的峰型；V型是直链淀粉和脂肪酸、乳化剂、醇类和碘等配体形成的复合物，在7.8°、12.5°和19.5°处有衍射峰，它是以单螺旋结构构成的，一般与其他晶型共生存在[3]。

拉曼光谱是一种散射光谱，通过拉曼散射峰的强度、位置来反映分子振动或转动，分析化合物分子中不同的官能团或化学键，以此获取化学物中分子结构的信息[4]。

淀粉结晶结构的不同是由于分子的排列方式和晶体取向不同[5]，对淀粉进行不同处理时，分子排列发生改变，晶体结构会改变，拉曼光谱也会出现相应变化，因此，拉曼光谱可以应用于淀粉晶体结构的研究[6-8]，SCHUSTER[9]等用α-淀粉酶和淀粉糖苷酶水解淀粉，研究糊化和水解过程中淀粉的拉曼谱图特征；LIU[10]等研究了拉曼光谱在玉米淀粉结构及其结晶度计算中的应用；PICCININI[11]等使用近红外傅里叶变换拉曼光谱来检测面包屑的淀粉回生。目前，通过拉曼光谱对淀粉结构有了一定的了解，所以，可以利用其检测原理对食品原料的某些特性进行进一步的研究。

本文以马铃薯淀粉为原料,通过酸解、重结晶等步骤制备酸解淀粉、B型微晶淀粉及V型淀粉-正癸醇/十二醇复合物，并运用PeakFit v4.12软件对其拉曼光谱谱图进行分析研究，为淀粉的改性提供理论基础和实验依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

马铃薯淀粉(食品级)，河南恒祥进出口有限公司；正癸醇(分析级)，阿拉丁生化科技股份有限公司；十二醇(分析级)，阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇(分析级)，天津市富宇精细化工有限公司；浓HCl(分析级)，开封市芳晶化学试剂有限公司；异丙酮：分析级，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2　仪器与设备

Acton Spectra Pro500i 拉曼光谱仪,英国雷尼绍贸易有限公司；SHB-Ш 循环水式真空泵,郑州长城科工贸有限公司；DZKW-D-2 数显恒温水浴锅,北京光明医疗器械厂；YP6102 电子天平,上海光正医疗仪器有限公司；LG10-2.4A高速离心机,北京医用离心机厂。

1.3　实验方法

1.3.1淀粉的纯化

称量100 g天然马铃薯淀粉置于500 mL的三口烧杯中，加入200 mL异丙酮纯溶液，上置冷凝管，加热至沸腾后，回流30 min后，使用布氏漏斗进行减压抽滤，滤饼用无水乙醇反复淋洗3～4次，收集滤饼，在室温下晾干，得到纯化淀粉。

1.3.2淀粉的酸解

使用1.3.1得到的纯化淀粉制备酸解淀粉。将5.0 g马铃薯淀粉加入到100 mL 2.2 mol/L的HCl溶液中,配制成50 g/L的淀粉悬浮液,于35 ℃下进行酸解7 d,用砂芯漏斗减压抽滤,除去回收酸溶液,滤饼用去离子水抽滤洗涤多次,至pH值为7,残余的固体物质用乙醇和丙酮抽滤下淋洗2～4次,收集固体物质并在室温晾干备用[12]。

1.3.3B-型微晶的制备

使用1.3.2制得的酸解淀粉制备B-型微晶淀粉。将100 mL蒸馏水加入5.0 g酸性淀粉中制成50 g/L的淀粉溶液，加热至80 ℃使淀粉溶解，然后冷却，离心，上清液在-18 ℃条件下冷冻12 h，之后在室温条件下解冻。解冻后只剩下少量冰，残留物立即过滤，用冰水洗涤，室温条件下干燥，最终得到B型微晶淀粉[10]。

1.3.4淀粉-醇类复合物的制备

将2.00 g B型微晶淀粉添加到500 mL的三口瓶中，加入40 mL蒸馏水，使用磁力搅拌器加热，温度为135 ℃，转速1 360 r/min，上接回流装置，待沸腾5 min后，缓慢向沸腾溶液中滴加正癸醇-乙醇溶液(一定量正癸醇溶于一定体积无水乙醇中)，继续加热10 min，转移到一定温度的恒温水浴槽中，封口静置一段时间，然后缓慢冷却至室温，放置24 h。离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀物，反复离心2次，得到白色沉淀物，冷冻干燥12 h，研磨，所得样品即为直链淀粉-正癸醇复合物[13-14]。

直链淀粉-十二醇复合物的制备方法同1.3.4中直链淀粉-正癸醇复合物的制备方法，只需将正癸醇换成十二醇。

1.3.5样品的X-射线(XRD)测试

取适量复合物样品置于正方形托盘的圆形螺纹中(圆形直径大小为约为10 cm，厚约为115 mm)，使用光滑的玻片压平，用Burker D8型X射线衍射仪测定，所用波长为0.154 2 nm的单色Cu-Kα射线。测试条件为：管压40 kV，管流30 mA，扫描区域5°～35°，采样步宽0.02°，扫描方式为连续，重复次数为1。

1.3.6样品的拉曼光谱测试

拉曼光谱测试采用英国Renishaw的Inviaplus型显微共聚焦拉曼光谱，激发光源为半导体激为532 nm，激光功率为50 mW，20倍长焦物镜背向散射测量模式，扫描次数20次，曝光时间为10 s。取少量样品放入铝杯中，使用100 mV的激光照射，在180°范围内收集散射辐射，波数范围为100～3 250 cm-1[15]。

1.3.7数据处理

利用Origin6.1作图软件对数据进行处理、绘图。使用 PeakFit v4.12对数据进行分峰拟合处理。

2　结果与分析

2.1　淀粉样品的XRD图谱分析

图1为马铃薯淀粉经过一系列不同处理后的X-射线衍射图。可以看出,原淀粉、酸解淀粉和重结晶淀粉在5.9°、17.1°、22.3°、24.0°附近存在较强的衍射峰，属于B型结构。d，e是B型微晶淀粉和正癸醇与十二醇的复合物，在7.8°、13.4°、20.9°处有尖锐的特征峰，呈现V型结构。淀粉的B型结构和V型结构的晶型存在较大的差异。

a-马铃薯原淀粉; b-酸解淀粉; c-B型淀粉;d-淀粉-正癸醇复合物; e-淀粉-十二醇复合物图1　不同处理方式所得的马铃薯淀粉XRD图Fig.1　X-ray diffraction pattern of starch

2.2　不同结晶结构淀粉样品的拉曼图谱解析

不同结晶结构的马铃薯淀粉拉曼光谱图及图谱分析见图2和表1。可以看出，样品出现的散射特征峰位置一致。从原淀粉到直链淀粉与正癸醇复合过程中，拉曼光谱特征峰强度逐步下降。其中，酸解过程中，峰强度变化非常大。原淀粉中含有大量的结晶结构，使得峰强度很高，酸解后，峰强度极大地降低，是因为在酸解过程中，很多无序排列结构被除去，分子变得有序，构象的数量减少，导致了峰强度的降低。其次，重结晶过程中，峰强度进一步降低，1 120 cm-1处的特征峰变缓，呈圆包凸出状，近乎消失，是因为在这个过程中，有序的淀粉在热水中加热时，变得无序，然后冷却时，无序的结构发生重结晶，再聚集成有序结构，2种有序结构是不同的，在这个过程中，水分渗出，结晶度增加，B型微晶形成，故两者的拉曼光谱也表现出了较大的差异。这与前人[9]的研究结果一致。直链淀粉与正癸醇复合过程中，475.534、938.91、2 909.45 cm-1处的峰再次降低，这是非晶结构转化成结晶结构的结果。此外，复合后，2 909.45 cm-1处的光谱波形不变，峰顶部变得狭窄，这是由于正癸醇分子进入单螺旋，与淀粉微晶复合。2种复合物的峰形基本一致，强度上相差较大，直链淀粉-十二醇复合物在2 909.45 cm-1处的峰强度达到17 800.70，而直链淀粉-正癸醇复合物的峰强度是8 099.46。在入射光相同的情况下，出现峰强度的差异，可能与配体的差异或不同的复合条件有关。从整体上看，不同晶型淀粉的结构有很大差异，这印证了X-衍射得到的结果。

a-马铃薯淀粉; b-酸解淀粉; c-B型微晶淀粉; d-直链淀粉-正癸醇复合物;e-直链淀粉-十二醇复合物图2　不同结构淀粉的拉曼光谱与局部拉曼光谱Fig.2　Raman spectra and the local Raman spectra of starch

样品特征衍射峰强度475.534cm-1938.91cm-11337.09cm-12909.45cm-1马铃薯淀粉12579.507913.758123.3833029.10酸解淀粉6005.333791.753955.4214902.70B型微晶淀粉3273.342253.031915.508378.17直链淀粉-正癸醇复合物2658.581790.692584.248099.46直链淀粉-十二醇复合物4961.624442.476485.2317800.70

不同结晶结构的马铃薯淀粉拉曼特征振动对比见表2。拉曼光谱中图谱基线的高低对应于样品中荧光性杂质的含量。从表2中可以看出，经过一系列不同的处理后，不同结构的拉曼光谱位置，除少数发生轻微偏移外，主要的散射特征峰基本无变化，特征峰强度逐步降低，这可能是由于淀粉的进一步提纯导致，在每一步处理中，淀粉经过了蒸馏水和无水乙醇的多次洗涤，除去了大部分的荧光性杂质，使淀粉的基线不断降低。淀粉-十二醇复合物各峰值强度增大，可能是由于配体不同。马铃薯原淀粉在815 cm-1处有峰，而其他3种消失。476.62 cm-1处的峰是由吡喃糖环中C—O—C的骨架振动和δ(C—C—O)引起，表示的是多糖的聚合度，是淀粉的特征峰[16]，峰强度比2 909.45 cm-1处C—H伸缩的峰强度低。861.84 cm-1处的峰来源于C—O—C环和C1—H弯曲振动，938.91 cm-1处是α-(1→4)糖苷键的C—O—C的弯曲振动引起[17-18]。

表2　不同结构淀粉的拉曼特征振动对比Table 2　Raman characteristic vibration of starch

注：a, b分别表示左偏移，右偏移；*表示该处光谱消失。

2.3　800～1 500 cm-1图谱区淀粉结构分析

对不同处理后的淀粉样品的吸收峰进行分峰,可以获得淀粉的每个官能团的吸收峰及其峰面积。不同结构淀粉800～1 500 cm-1分峰图谱见图3。平滑度SM设定7.19%，基线误差限tol设定3.0%，扫描放大值Amp设定1.50%，拟合度R达到97.9%。图3上侧曲线是经过拟合后的谱线，下侧曲线为拟合分离出的谱线，将图3中各特征峰曲线进行分析处理，计算800～1 500 cm-1内的吸收峰相对峰面积列于表3中[19]。为了消除检测过程中因处理方式不同带来的峰面积的不可比性,以1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1处吸收峰面积之和为标准峰来计算800～1 500 cm-1

图3　淀粉样品的分峰图谱Fig.3　Raman spectra of starch samples by peakfit

内各吸收峰的相对峰面积。计算公式为：

(1)

式中：Rx，X位置处吸收峰相对峰面积；Px，分峰所得X位置处吸收峰面积；P标，分峰所得1 033，1 085.9，1 131.2 cm-1处吸收峰总面积。

表3　peakfit分峰拟合后所得拉曼吸收峰的相对峰面积Table 3　Relative peak areas of starch samples by peakfit

由图3和表3可知，处理后得到的不同淀粉，经过分峰拟合后，峰位置基本不变，拟合峰分别出现在856.13、931、1 033、1 085.9、1 131.2、1 213.7、1 261.3、1 336.1、1 388.9、1 455 cm-1等处，1 131.2，1 336.1 cm-1处的峰与淀粉的单螺旋结构相关，淀粉与配体复合时，双螺旋解旋为左手单螺旋结构[20]，使复合物中单螺旋结构增加，表现为1 131.2、1 336.1 cm-1处相对峰面积增大。在800～1 500 cm-1之间，两种复合物也可以拟合成10个峰，且相对峰面积大致相同，可以看出复合过程对该处影响不大。

2.4　2 909.45 cm-1处淀粉结构分析

对2 909.45 cm-1处的拉曼光谱进行分峰处理，不同结构淀粉的分峰图谱见图4。

平滑度SM设定2.96%，基线误差限tol设定3.0%，扫描放大值Amp设定1.50%，拟合度R达到97.9%。将图4中各特征峰曲线进行分析处理，计算各吸收峰相对峰面积列于表4。以2 911，2 965 cm-1处特征峰面积之和为标准峰来计算各吸收峰的相对峰面积，计算公式同式(1)。

由图4和表4可知，经过分峰拟合后，样品的峰位置基本不变，拟合峰分别出现在2 911 cm-1和2 965 cm-1等处，其中原淀粉，酸解淀粉和B型淀粉的相对峰面积基本一致，均为0.34左右，复合物的相对峰面积为0.40左右。复合后，在2 965 cm-1处的分峰面积增大。因此，复合过程对2 909.45 cm-1处的峰影响较大。淀粉-十二醇复合物的峰面积大，可能与配体链长有关，即链越长，该配体复合物在2 965 cm-1处的峰面积越大。

图4　五种不同结构淀粉的分峰图谱Fig.4　Raman spectra of starch by peakfit

样品特征衍射峰面积2911cm-12965cm-1相对峰面积R脱脂原淀粉2.14×1061.125×1060.34酸解淀粉7.17×1053.73×1050.34B型微晶淀粉4.16×1052.23×1050.35淀粉-正癸醇复合物3.34×1052.07×1050.38淀粉-十二醇复合物5.36×1053.83×1050.42

3　结论

X-衍射图谱表明，马铃薯原淀粉、酸解马铃薯淀粉和B型淀粉微晶均为B型结构，复合物为V型结构。以马铃薯淀粉为原料，对比不同结晶结构淀粉的拉曼光谱，结果表明，从原淀粉到直链淀粉与正癸醇复合过程中，拉曼光谱特征峰强度逐步下降。

对比不同醇的复合物，不同复合物的特征峰位置基本一致，强度上相差较大，可能是由于配体差异或条件的不同。使用PeakFit v4.12对拉曼散射峰进行分峰处理。分峰拟合的相对峰面积也发生了变化，淀粉与配体复合时，双螺旋解旋为左手单螺旋结构，使复合物中单螺旋结构增加，表现为1 131.2 cm-1和1 336.1 cm-1处相对峰面积增大。2 965 cm-1处醇复合物的相对峰面积随配体链长的增大而增大。

[1]JOHN E F, RICHARD J, Surface pores of starch granules[J].Cereal Chem, 1992, 169(3): 284-288.

[2]HUC D, MATIGNON A, BAREY P, et al. Interactions between modified starch and carrageenan during pasting[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 36(2): 355-361.

[3]MARIUSZ W, RAFAZ, LESAW J, et al. Starch and starch derivatives in gluten-free systems A review[J]. Journal of Cereal Science, 2016, 67: 46-57.

[4]BEMILLER J N, WHISTLER R. Starch Chemistry and Technology [M]. 3th ed. New York: Academic Press, 2009.

[5]THYGESEN L G, LOKKE M M, MICKLANDER E, et al. Vibrational microspectroscopy of food. Raman vs. FT-IR[J]. Trends in FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2003, 14(1): 50-57.

[6]SCHNUPF U, WILLETT J L, WAYNE B, et al. DFT conformation and energies of amylose fragments at atomic resolution. Part 1: syn forms of α-maltotetraose[J]. Carbohydrate Research, 2009, 344(3): 362-373.

[7]陈瑶, 代剑华, 周学谦, 等. 拉曼光谱分析癌变胃黏膜组织中蛋白质改变的研究[J]. 重庆医学, 2014, 43(29): 3 875-3 878.

[8]马春丽, 李芳菲, 周强, 等. 正庚烷相变序列的高压拉曼光谱研究[J]. 光散射学报, 2012, 24(4): 375-380.

[9]申晓波, 郝世明. 生活用水的拉曼光谱分析[J]. 广西物理, 2009, 30(2): 22-24.

[10]SCHUSTER K C, EHMOSER H, GAPES J R, et al. On-line FT-Raman spectroscopic monitoring of starch gelatinisation and enzyme catalysed starch hydrolysis[J]. Vibrational Spectroscopy, 2000, 22(1/2): 181-190.

[11]LIU Yan-qi, XU Ying, YAN Yi-zhe, et al. Application of Raman spectroscopy in structure analysis and crystallinity calculation of corn starch[J]. Starch/Stärke, 2015, 67(7-8): 612-619.

[12]PICCININI M, FOIS S, SECCHI N, et al. The Application of NIR FT-Raman Spectroscopy to Monitor Starch Retrogradation and Crumb Firmness in Semolina Bread[J]. Food Analytical Methods, 2012, 5(5): 1 145-1 149.

[13]刘延奇, 于九皋, 孙秀萍. A-型淀粉球晶的制备与表征[J]. 中国粮油学报, 2004, 19(1): 31-34.

[14]刘启玲, 刘延奇. V型直链淀粉-正辛醇复合物的制备及结晶结构的研究[J]. 食品工业科技, 2016, 37(9): 123-126.

[15]刘延奇, 解慧芳, 史苗苗, 等. V型直链淀粉-十二醇复合物的制备工艺研究[J]. 食品科技, 2016, 41(3): 260-263.

[16]刘延奇, 胡丹丹, 徐瑛, 等. 拉曼光谱在淀粉结晶结构表征中的应用研究[J]. 食品科技, 2015, 40(1): 315-318.

[17]KIZIL R, IRUDAYARAJ J, SEETHARAMAN K. Characterization of irradiated starches by using FT-Raman and FT-IR spectroscopy [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(14): 3 912-3 918.

[18]BENZERDJEB A M, MOKHTARI I N T, RAHAL M S. Normal coordinates analyses of disaccharides constituted byD-glucose,D-galactose andD-fructose units [J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2007, 68(2): 284-299.

[19]GUSSEM K D, VANDENABEELE P, VERBEKEN A, et al. Raman spectroscopic study of Lactarius spores (Russulales, Fungi) [J]. Spectrochim Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2005, 61(13/14): 2 898-2 908.

[20]李祥, 秦志宏, 卜良辉等. 炼焦煤的官能团结构分析及其黏结性产生机理[J]. 燃料化学学报, 2016, 44(4): 385-393.

[21]PUTSEYS J A, DERDE L J, LAMBERTS L, et al. Production of tailor made short chain amylose-lipid complexes using varying reaction conditions[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 78(4): 854-861.