高慧娟，冯九海，韩玉琦，刘军杰，马红利，魏生龙*

1(甘肃省应用真菌工程实验室，河西学院，甘肃 张掖，734000)2(河西学院 农业与生物技术学院，甘肃 张掖，734000)3(甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖，734000)

荷叶离褶伞(Lyophyllumdecastes(Fr.) Singer)是一种营养价值和药用价值都很高的菌类[1-3]。且荷叶离褶伞菌丝体具有一定的富硒能力，在富硒的发酵过程中，硒的加入可有效提高菌丝体的干重[4]。

硒元素是生命活动的必需元素，开发高效的富硒食品具有重要的意义[5-6]。多糖和硒结合成为硒多糖，是一种多糖有机硒化合物，其生物药理活性普遍高于多糖和硒，更容易被机体吸收和利用[7]。硒多糖具有多种生理功能，可抗衰老、防治癌症，治疗多种免疫缺损疾病，诱导干扰素的产生，促进蛋白质和核酸的生物合成等多方面的生物活性[8-9]。天然硒多糖分布于许多动植物和微生物体内，尤其是存在于植物体内已经得到证实[10]。然而，对硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚，在硒多糖的分子生物学研究、构效关系以及作用机制等方面的直接证据和实验更是不足[11]。

本研究以20 L生物罐发酵富硒的荷叶离褶伞菌丝体为原料，通过4个单因素试验，探讨提取时间、温度、料液比和提取次数对荷叶离褶伞菌丝体多糖提取的影响，初步优化其提取工艺；再通过Box-Behnken中心组合的响应面试验，借助Design Expert 8软件对多糖提取率进行方差分析，得到硒多糖的最佳提取工艺条件，将纯化后的硒多糖进行红外光谱比较分析，确定其组成结构，为荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的开发利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

荷叶离褶伞，由甘肃省应用真菌工程实验室提供；硒粉(化学纯CP)，国药集团化学试剂有限公司；蒽酮(分析纯)，上海中泰化学试剂有限公司；3,3′-二氨基联苯胺(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇，氯仿，正丁醇，葡萄糖，浓H2SO4，浓HCl，浓HNO3，甲苯，NaOH，EDTA-Na2试剂均为分析纯，水均为蒸馏水。

1.2　仪器与设备

V-1200型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；TDL-50大容量低速离心机(金坛市亿能实验仪器场)；LGJ-18冷冻干燥机(北京松源华科技发展有限公司)； RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；B260恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；DHG-9423A电热恒温鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3　实验方法

1.3.120 L生物罐发酵制备荷叶离褶伞菌丝体

富硒荷叶离褶伞菌丝体的制备：称取黄豆100 g，浸泡12 h后打浆，煮沸5 min，冷却至40 ℃加入5%蛋白酶，恒温水浴8 h后用300目筛过滤，滤液备用；称取玉米面600 g，按1∶10(g∶mL)加入65 ℃热水，后加入5%的淀粉酶，恒温水浴至水解液遇碘液无色为止，用300目筛过滤，滤液备用。

把黄豆酶解液和玉米淀粉酶解液的滤液混合，加入葡萄糖200 g，定容至20 L发酵罐中，121 ℃灭菌40 min，快速冷却至22 ℃，接入10%的荷叶离褶伞三角瓶种子培养液，通入无菌空气，使罐内压强为0.02 MPa的条件下培养，在发酵的第3天加入灭菌的Na2SeO3溶液，使其在发酵罐中浓度为4 μg/mL，发酵的第8天终止发酵，过滤，得到的菌丝体用清水清洗3遍，在冷冻干燥机中冻干，即为富硒的荷叶离褶伞菌丝体。

未富硒荷叶离褶伞菌丝体制备：在发酵过程中不加入灭菌的Na2SeO3溶液，其他过程同富硒菌丝体的制备。

1.3.2多糖的提取方法

多糖提取工艺流程： 20 L生物罐发酵的富硒菌丝体→干燥→打粉→超声提取→离心→取上清液→浓缩→乙醇沉淀多糖→脱脂→Sevage试剂除蛋白→定容→测定含量多糖提取方法：将20 L生物罐发酵的富硒荷叶离褶伞菌丝体，放入真空干燥箱中进行干燥，磨粉过100目筛制成标准粉[12]。精密称取该样品0.500 0 g，进行超声提取，提取后在3 000 r/min的转速下离心15 min，合并上清液并减压浓缩(≤50 mL)，加入3倍体积的体积分数为95%乙醇，4 ℃冰箱中静置12 h[13]，得多糖沉淀，沉淀经乙醇反复洗涤后，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50 mL备用。

1.3.3Sevage试剂除去蛋白质

量取浓缩液的体积为V(mL)，向其加入1/5V的三氯甲烷和1/20V的正丁醇，振荡20 min，在3 000 r/min的转速下离心15 min，合并上清液并测其体积，继续加相应体积的三氯甲烷和正丁醇，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀[14]。

1.3.4多糖含量的测定

将葡萄糖放置于50～80 ℃的烘箱中烘8～10 h，取出后精确称取0.010 0 g，加蒸馏水定容至100 mL，配制为0.1 mg/mL备用。

取7支15 mL洗净并干燥的具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加蒸馏水至2.0 mL，再精确加入硫酸蒽酮溶液(蒽酮0.1 g，80%硫酸溶液100 mL，溶解摇匀)6.0 mL后摇匀，沸水浴15 min，取出后放入冰浴冷却15 min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[15]。

取15 mL洗净并干燥的具塞试管，精密量取样品溶液2.0 mL加入，再精密加入硫酸蒽酮溶液6.0 mL后摇匀，沸水浴15 min，取出后放入冰浴冷却15 min，以相应试剂或蒸馏水为空白，在625 nm波长处测定吸光度，代入线性回归方程求出供试样品溶液中多糖含量，再计算菌丝体样品的多糖提取率。

(1)

式中：Y为供试样品溶液中标准曲线中查得多糖的质量(mg)；N为稀释倍数；V为定容体积(50 mL)；m为试验样品质量(g)；VS为样品测定液的体积(2 mL)。

1.3.5硒含量的测定

精确称取0.100 0 g硒标准品溶解于2 mL浓HNO3中，低温下(≤100 ℃)加热溶解至蒸干，用1∶1(体积比)HCl溶解，定容至1 L，使用时稀释至1.0 μg/mL。

准确吸取上述硒标准溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置于125 mL分液漏斗中，加水定容至25 mL，分别加入5% EDTA-Na2溶液1 mL，用1∶1 HCl调节溶液至pH 2～3，再加入0.5% 3,3′-二氨基联苯胺溶液4 mL(现用现配)，摇匀，置暗处20 min后，用质量分数10% NaOH溶液调节至中性，加入10 mL甲苯振荡2 min，静置分层，弃水层，甲苯层用比色皿于420 nm处测其吸光值(以相应试剂为空白)，以硒含量为横坐标(μg)，吸光度为纵坐标，绘制硒标准曲线[16]。

称取0.050 0 g富硒菌丝体样品溶于2 mL浓HNO3，在电热炉中加热(控制温度160～180 ℃)消化，至样品完全溶解，溶液呈澄清，停止加热并冷却至70 ℃，加入1∶1 HCl，定容4 mL后备用。

准确移取上述备用溶液0.5 mL，定容至25 mL后，取出4mL定容至25 mL，并转入125 mL分液漏斗中，加水定容至25 mL，分别加入5% EDTA-Na2溶液1 mL，用1∶1 HCl调节溶液至pH 2～3，再加入0.5% 3,3′-二氨基联苯胺溶液4 mL，摇匀，置暗处20 min后，用10%NaOH溶液调节至中性，加入10 mL甲苯振荡2 min，静置分层，弃水层，甲苯层用比色皿于420 nm处测其吸光值，以相应试剂为空白。根据样品溶液测得的吸光值，结合硒标准曲线计算相应的硒含量。

1.3.6单因素试验方法

1.3.6.1提取时间对多糖提取的影响

精密称取富硒菌丝体样品0.500 0 g，在提取时间分别为15、30、45、60、75 min，提取温度为60 ℃，料液比1∶60的条件下超声提取1次。提取后在3 000 r/min 的转速下离心15 min，将清液减压浓缩后(≤50 mL)，加入3倍体积95%乙醇，4 ℃冰箱中静置12 h，得多糖沉淀，沉淀经乙醇反复洗涤，用Sevage试剂除去蛋白质，最后将上清液定容至50 mL。采用蒽酮比色法测定多糖的含量，并计算多糖提取率，研究提取时间对多糖提取的影响。

1.3.6.2提取温度对多糖提取的影响

精密称取样品(标准粉)0.500 0 g，在提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃，提取时间为45 min，料液比1∶60条件下超声提取1次。提取后同1.3.3测定多糖的含量，并计算多糖提取率，以此来研究提取温度对多糖提取的影响。

1.3.6.3不同料液比对多糖提取的影响

精密称取样品(标准粉)0.500 0 g，在料液比分别为1∶40、1∶80、1∶120、1∶160、1∶200时向每个三角瓶中加入蒸馏水，提取时间为45 min，温度80 ℃的恒温条件下超声提取1次。提取后同1.3.3测定多糖的含量，并计算多糖提取率，以此来研究料液比对多糖提取的影响。

1.3.6.4提取次数对多糖提取的影响

精密称取样品(标准粉)0.500 0 g，在提取次数分别为1、2、3、4次，提取时间为45 min，料液比为1∶120，80 ℃的恒温条件下提取，提取后同1.3.3测定多糖的含量，并计算多糖提取率。来研究提取次数对多糖提取的影响。

1.3.7响应面试验方法

在4个单因素试验基础上，选定影响因素并确定因素水平，用Box-Behnken中心组合原理[17]。设计响应面试验表格。以多糖提取率为参考指标，来确定多糖提取的最佳提取工艺条件。选取对多糖提取影响的4个因素，即：提取时间、提取温度、料液比数和提取次数，分别以A、B、C和D表示。试验因素水平设计见表1。

1.3.8未富硒荷叶离褶伞菌丝体中多糖的提取

在富硒荷叶离褶伞菌丝体中，多糖提取的优化条件下，对未富硒荷叶离褶伞菌丝体中多糖进行提取。

表1　Box-Behnken 设计试验因素与水平Table 1　Factors and levels in Box-Behnken design

1.3.9硒多糖的红外色谱检测

分别取1 mg干燥纯化的富硒菌丝体和未富硒菌丝体中多糖样品，与100～200 mg干燥的KBr粉末在研钵中轻轻研磨均匀，在红外灯下操作，经压片机压成薄片，于4 000～400 cm-1进行红外光谱测定[18]。

2　结果与分析

2.1　葡萄糖标准曲线

以吸光值(OD值)为纵坐标，多糖质量(mg)为横坐标，得回归方程Y=4.69X-0.008 1，相关系数R2=0.999 2，符合精度要求，如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　Standard curve of glucose

2.2　硒标准曲线及硒含量

硒标准曲线的回归方程：以吸光值(OD值)为纵坐标，硒含量(μg)为横坐标，绘制得标准曲线(图2)。

图2　硒标准曲线Fig.2　Standard curve of selenium

得回归方程Y=0.015 1X-0.001 4，相关系数R2=0.993 4，具有较好的相关性。

根据硒标准曲线计算，得出荷叶离褶伞菌丝体中富硒量达到114.2 μg/g，说明荷叶离褶伞菌丝体中是富含硒的。由于硒含量测定方法操作复杂，花费时间长，综合考虑后，以多糖提取率的变化来说明荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖提取的变化。

2.3　提取时间对多糖提取的影响

随着时间的延长，硒多糖的提取率逐渐增加，45 min时多糖提取率达到最大值10.97%，之后随着提取时间的延长，多糖提取率又有所减少(见图3)。结果表明，多糖的提取过程与时间密切相关，超声时间较短则产物溶解不充分，时间过长又出现大分子多糖在超声波的强剪切作用下降解的现象，而导致多糖损失[18]。从节约能源、减少生产周期考虑，提取时间在45 min左右为宜。

图3　提取时间对多糖提取率的影响Fig.3　Effect of extraction rate time on the polysaccharide

2.4　提取温度对多糖提取的影响

在50～80 ℃内，随着提取温度的升高，多糖提取率逐渐增加，80 ℃后随着提取温度的升高，多糖的提取率反而下降(见图4)。

图4　提取温度对多糖提取率的影响Fig.4　Effect of extraction rate temperature on thepolysaccharide

与单斌等[19]在响应面法优化超声辅助提取苦瓜多糖工艺的研究中基本一致，由此说明不同植物多糖提取的最佳温度不同，但其多糖的提取的变化趋势相同。这是由于在升温和超声作用下，当液体所受到的负压足够大时，媒质分子间的平均距离超过极限距离后，就会破坏液体结构的完整性，造成空穴。综合考虑，提取温度选择80 ℃较适宜。

2.5　不同料液比对多糖提取的影响

由图5可知，在料液比较低时，多糖的浸出量随料液比的增大而显著增加，并在料液比1∶120时多糖提取率达到33.94%，但增大到一定程度后，多糖提取率基本不再变化。考虑到后序操作工艺与成本问题，选择料液比1∶120为宜。

图5　料液比对多糖提取率的影响Fig.5　Effects of extraction rate material to water on thepolysaccharide

2.6　提取次数对多糖提取的影响

随着提取次数的增加，多糖提取率几乎呈直线下降。提取1次时，大部分多糖已被提取；将滤渣再次提取时，有部分多糖被提取；提取第3、4次时，多糖提取率接近于零，结果见图6。从节省能耗与缩短生产周期考虑，提取次数选择2次为宜。

图6　提取次数对多糖提取率的影响Fig.6　Effect of extraction rate times on the polysaccharide

2.7　响应面试验结果与分析

2.7.1模型的建立及显著性检验与分析

根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，综合单因素影响试验结果，采用4因素3水平的响应面分析方法进行实验设计，分析因素与设计见表2，表中的数据经 Design-Expert 8统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表3。

表2　响应面分析实验方案与结果Table 2　Box-Behnken experimental design andexperimental results for response surface analysis

用Design Expert 8程序软件对表2中的试验结果进行回归分析，对各因素回归拟合后，得到多糖提取率四因素间的元二次回归方程：

Y=-334.643 64+1.422 04A+5.957 62B+1.251 32C+12.919 23D+8.486 14×10-3AB-1.945 63×10-4AC+0.033 333AD+1.500 53×10-3BC+0.062 313BD-0.021 828CD-0.026 48A2-0.040 372B2-5.154 48×10-3C2-3.551 01D2

对回归方程进行方差分析和显著性检验结果如表3所示。式中Y为多糖提取率，A、B、C和D为上述4个变量的编码值。回归项中p<0.000 1，说明所选择模型高度显著；失拟项p=0.974 4>0.05，即失拟项差异不显著，表明该二次回归模型能够较显著拟合试验；回归模型R2=0.945 6，说明该模型能够解释94.56%的响应值变化，只有5.44%的变异不能用该模型解释。因此该模型是极其显著而且可靠的，能够对多糖提取进行预测。

图7反映了各因素交互作用对荷叶离褶伞菌丝体中多糖提取率的影响，比较6组图可知：料液比对多糖提取率的影响较大，曲线变化较陡；提取时间次之；提取温度对多糖提取率的影响最小，曲面变化比较平缓。

2.7.2最佳提取工艺的确定及验证试验

借助Design Expert 8统计分析软件进行数据分析，得到最佳提取工艺条件：提取时间50.45 min、提取温度83.3 ℃、料液比1∶127.47 (g∶mL)、提取次数2.39次，理论上多糖提取率为44.60%。为了实际操作方便，调整其最佳提取工艺条件为提取时间50 min、提取温度83 ℃、料液比1∶130 (g∶mL)、提取次数2次。在此条件下，对荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖进行提取，通过3次平行试验，测得多糖提取率为44.62%，与预测的理论值相差甚少，再次验证了回归模型的正确性。并用3,3′-二氨基联苯胺分光光度法测定硒含量，由硒标准曲线计算得硒含量为31.9 μg/g。说明该方程和实际的情况比较相符，实验结果充分验证了模型的正确性，说明荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的提取工艺优化结果是有效的。

表3　响应面分析试验方差分析结果Table 3　Analysis of variance for the developed regression model

注：*差异显著(p<0.05)；**差异极显著(p<0.01)。

A-提取时间与提取温度; B-提取时间与料液比C-提取时间与提取次数;D-提取温度与料液比;E-提取温度与提取次数;F-料液比与提取次数图7　各因素交互作用对荷叶离褶伞菌丝体多糖提取率影响的响应面图Fig.7　Response surface plots showing the interactive effectsof various extractio conditions on extraction rate polysaccharideLyophyllum decastes mycelia

2.8　荷叶离褶伞菌丝体中硒多糖的结构分析

图8　未富硒荷叶离褶伞菌丝体中水溶性多糖的IR图谱Fig.8　IR spectrum of water-soluble polysaccharidein common Lyophyllum decastes mycelia

图9　富硒荷叶离褶伞菌丝体中水溶性多糖的IR图谱Fig.9　IR spectrum of water-soluble polysaccharidein Se-enriched Lyophyllum decastes mycelia

3　讨论

本试验以20 L生物培养罐发酵的荷叶离褶伞菌丝体为原料，通过4个单因素试验，探讨提取温度、提取时间、料液比和提取次数对多糖提取的影响，初步优化提取工艺；再通过Box-Behnken中心组合原理设计了4因素3水平的响应面试验，借助Design Expert 8软件处理数据，并进行多元回归分析，得到了4个单因素与多糖提取率的回归模型，分析各因素交会作用对荷叶离褶伞菌丝体中多糖提取率的影响，最终得到模型最优值时的最佳提取工艺条件：提取时间50.45 min、提取温度83.3 ℃、料液比1∶127.47 (g∶mL)、提取次数2.39次，预测多糖提取率为44.60%。为了试验操作的可行性，调整提取时间为50 min、提取温度83 ℃、料液比1∶130 (g∶mL)、提取次数2次，测得多糖提取率为44.62%，此时多糖中硒含量达到31.9 μg/g。本文通过响应面分析法建立了各因素与响应值之间的数学模型，可以较直观地看出不同因素之间的交互作用，有针对性地对其进行调整，可减少试验次数，提高效率，在实际生产中有广泛的应用价值。

通过富硒前后2种形态硒多糖的红外光谱结构分析可知，通过醇沉方法提取的可溶性多糖具有多糖的一般特征吸收峰, 且是β-糖苷键连接的吡喃多糖。富硒未改变水溶性硒多糖的主体结构，但多糖的结构发生了改变。

近年来，人们通过人工方法获取硒多糖，即在适宜培养条件下将无机硒添加到真菌、藻类等的培养基中，通过真菌、藻类等的生长代谢，对硒进行富集和生物转化来获得硒多糖。查阅相关文献得知，硒多糖的提取分离方法与一般多糖的提取分离方法相似。但对大多数天然硒多糖或生物富集硒多糖中硒以何种方式进入、与何种单糖结合、结合的位点如何等问题还未见报道，有待于进一步研究。

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