孙敏，袁凤霞，曹晓虹，刘建利，王军节，张琇,李靖宇，覃璐琪，邓鹏程，王晓丹

(北方民族大学 生物科学与工程学院，发酵酿造工程生物技术国家民委重点实验室，宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室，宁夏 银川，750021)

目前，用于酸乳发酵工业生产的保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)等菌株，只是发酵特性优良的菌种，而非益生乳酸菌[1-2]。胃是重要的消化器官，胃液的强酸性环境和其中的蛋白酶共同构成了阻止大多数微生物进入肠道的天然屏障，肠道pH 8.0的弱碱性环境及其分泌的胆汁、胰蛋白酶也对外源微生物有拮抗作用。因此，耐受胃肠道环境，是益生乳酸菌的最基本特性。而乳酸菌胃肠道环境耐受性的研究大多仅仅集中菌株筛选，很少同时兼顾考察其优良发酵特性的研究[3-11]。本课题组前期已从新疆、西藏、青海、内蒙、甘肃、云南等全国20个省份的少数民族传统发酵食品中分离得到大量的乳酸菌，本研究拟从中筛选耐胃肠道环境的乳酸菌菌株，并进行酸乳发酵试验，为开发益生优良酸乳发酵菌剂提供候选菌种和理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1乳酸菌株

本实验室保存的从新疆、西藏、青海、内蒙、甘肃、云南等全国20个省份的酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳饼、浆水、酵子、泡菜、酸菜等少数民族传统发酵食品中分离的乳酸菌，随机选取58株菌进行实验；保加利亚乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)，宁夏夏进乳业股份有限公司惠赠。

1.1.2实验试剂

胰蛋白酶，北京拜耳迪生物公司；胃蛋白酶、牛胆盐，Biotopped公司;胰蛋白胨、酵母抽提物英国Oxoid公司；牛肉浸粉，青岛海博生物公司；细菌基因组提取试剂盒，康为世纪生物科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)，北京全式金生物技术有限公司；柠檬酸二铵、柠檬酸铵、蔗糖、碘、三氯乙酸、邻苯二胺、HCl、NaHSO3、酚酞、NaOH、酒精、琼脂糖、CaCl2、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、无水乙醇、KOH,天津市大茂化学试剂厂,均为分析纯；纯牛奶,伊利乳业有限责任公司。

1.1.3溶液

酸溶液[12-15]：用1 mol/L HCl溶液调节生理盐水为pH 3.0，于121 ℃下灭菌20 min。

胆盐溶液[12-13,15]：准确称取0.3 g牛胆盐，加生理盐水溶解定容至100 mL，于121 ℃下灭菌20 min。

人工模拟胃液[12,14,16-17]：称取0.3 g胃蛋白酶，溶于100 mL 50 g/L NaCl溶液中，用1 mol/L HCl溶液调节为pH3.0，经微孔滤膜过滤除菌后备用。

人工模拟胰液[17-18]：称取0.1 g胰蛋白酶，溶于100 mL 50 g/L NaCl溶液中，用1 mol/L的NaOH溶液调整为pH 8.0，经微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.1.4培养基

MRS培养基(1 L)：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、柠檬酸二铵2 g、牛肉浸粉10 g、无水乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、MgSO40.58 g、K2HPO42.6 g、MnSO40.19 g，调节pH值为6.2～6.4之间。

1.1.5引物

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.6实验仪器

TMS-PRO型质构仪,美国FTC公司;NDJ-8S黏度计,上海庚庚仪器设备公司;S1000型快速梯度PCR仪，美国Bio-Rad公司；Q/BKYY15-2000型微型旋涡混合器、1-14型台式高速冷冻离心机，Sigma公司；SW-CJ-2J型，双人型超净工作台苏州净化设备有限公司；紫外分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司；HH-4型，水浴锅浙江余姚金电仪表有限公司；LDZX-50KBS型压力蒸汽灭菌器；ZWY-100H恒温培养振荡器；SD303-4A型数显电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1乳酸菌的活化

取保藏的菌株接入MRS液体培养基中，37 ℃，100 r/min摇床培养24 h，备用。

1.2.2乳酸菌菌株肠胃道耐受性实验

参考文献[3-5]方法，稍作改动。将活化后的菌株按2%的接种量接到MRS培养基中，培养24 h后，吸取培养液2 mL，12 000 r/min离心2 min，收集菌体，加入2 mL的无菌生理盐水重悬，准确吸取0.5 mL菌悬液分别加入4.5 mL酸溶液、胆盐溶液、人工模拟胃液和人工模拟胰液和生理盐水；37 ℃，100 r/min摇床培养4 h后，取500 μL处理液接种到5 mL的培养基中，于37 ℃ 100 r/min摇床培养8 h后，在600 nm处测量其吸光度值，按照以下公式计算存活率，以保加利亚乳杆菌存活率为对照(CK)。

(1)

式中：A，生理盐水吸光度值；B，各处理液吸光度值

1.2.3菌悬液制备

4 ℃，6 000 r/min离心活化的乳酸菌培养液5 min，弃去上层，加入无菌生理盐水制成浓度大于1×108CFU/mL菌悬液。

1.2.4酸乳的发酵

取灭菌后的玻璃瓶，每瓶加入30 mL含蔗糖的牛奶(100 g/L)，高压灭菌锅95 ℃灭菌5 min，待冷却后，接入乳酸菌菌悬液5 mL，40 ℃培养记录凝乳时间，凝乳后4 ℃冷藏24 h，进行后续酸乳特性评价，以保加利亚乳杆菌发酵酸乳为对照(CK)。

1.2.5酸乳特性评价

1.2.5.1感官评价

参考生庆海等[19]方法，制定感官品评表，将凝乳后的酸乳取出后，随机选8～15名学生依据感官评价标准对其气味、质地、口感3个指标进行感官评定，记录数据，计算平均值。

表1　酸乳感官评价打分表Table 1　The table of sensory evaluation scores on yoghourt

1.2.5.2持水力测定

参考张兰威[20]的方法，准确称取发酵后的酸乳15 g，4 500 r/min离心10 min，取上清液，称取质量。

(2)

1.2.5.3质构特性测定

参考文献[21-23]，测试探头型号为TMS-75 mm圆盘挤压探头P/75。测试条件如下：测前速率为30 mm/min；测后速率与测前速率一致；两次压缩之间的停留间隔：0 s；采样速度：10 Hz；最小触发力：0.3 N。

1.2.5.4黏度测定

转子为1～4号，转速在6～60 r/min，测量范围在(500～400 000)mPa·s。将40 mL待测酸乳于50 mL塑料离心管中，选择合适的转子置于酸乳中，调整转速，使检测值位于转子检测范围值中间，注意旋转时不要与管壁接触。

1.2.5.5滴定酸度测定

按照GB/T 5413—1997[24]，取250 mL三角瓶，加4 ℃存放1 d、3 d、7 d的酸乳5 g、40 mL冷却煮沸水和5滴已经配好的酚酞酒精溶液(质量浓度为5 g/L)，充分摇匀，用NaOH标准溶液(浓度为0.100 0 mol/L)滴定至微红色，在30 s内颜色不消失即为滴定终点，记录消耗的NaOH标准滴定溶液体积。将所得结果代入公式(3)计算滴定酸度。

式中：X，发酵乳样品的酸度，°T；c，NaOH标准溶液的摩尔浓度，mol/L；V，滴定时消耗NaOH标准溶液体积，mL；m，发酵乳样品的质量，g；0.1，酸度理论定义NaOH的摩尔浓度，mol/L。

1.2.6数据处理与分析

图表在Excel中生成，采用SPSS 11.0软件ANOVA对试验数据进行方差分析，用LSD进行多重比较。

1.2.7菌株分子鉴定

参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书；PCR扩增16S rDNA反应体系为(50 μL)：10×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、模板DNA 1μL、ddH2O 22μL。取3 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳检测，剩余PCR扩增产物由南京金斯瑞生物公司进行测序。将测序序列在EZBio Cloud数据库中比对鉴定。参考凌空等[25]的方法，以Bacillussubtilis16S rDNA序列(X60646.1)为外群，建系统发育树。

2　结果与分析

2.1　乳酸菌菌株肠胃道耐受性结果

在pH 3.0的酸溶液中，保加利亚乳杆菌(CK)存活率为35.75%，58株乳酸菌存活率在7%～99%之间，10%以下的有9株菌，10%～20%的有24株菌，20%～30%的有9株菌，30%～60%的有8株菌，60%～90%的有5株菌，90%以上的有3株菌，分别是菌株“新A22”(99.14%)、“新E6”(94.50%)和“新E10”(91.67%)；在胆盐溶液中，保加利亚乳杆菌(CK)存活率为55.88%，各菌株的存活率10%～98%之间，10%～20%的有9株菌，20%～40%的有7株菌，40%～60%的有25株菌，60%～90%的有14株菌，90%以上的有3株菌，分别是菌株“奶疙瘩3”(97.72%)、“兰州2”(96.34%)和“甘景4”(96.29%)；在人工模拟胃液中，保加利亚乳杆菌(CK)存活率为36.24%，各菌株的存活率8%～90%之间，10%以下的有11株菌，10%～20%的有25株菌，20%～40%的有10株菌，40%～70%的有4株菌，70%～80%的有6株菌，80%以上的有2株菌，分别是菌株“新A22”(89.46%)和“新B4”(87.53%)；在人工模拟胰液中，保加利亚乳杆菌(CK)存活率为87.82%，各菌株存活率均较高，介于30%～400%之间，甚至出现胰液会促进部分菌株的生长繁殖的情况，80%以下的只有3株菌，80%～90%的也只有4株菌，90%～100%的有15株菌，100%～150%的有32株菌，150%以上的有3株菌，分别是“陕渭7”(365.74%)、“平凉1”(182.48%)和“奶疙瘩3”(163.51%)，说明肠液中对菌株存活率影响较大的是胆盐而非胰蛋白酶。由于同一菌株在4种溶液中存活率差距较大，因此选择在各个处理溶液中存活率都达到了45%以上有“新E6”、“克1”、“新A22”、“新E10”、“银川1”、“新B4”、“鲜豆腐8”这7株菌(图1)，将这7株菌作为进一步试验候选菌株。

2.2　评估益生性菌株应用于发酵酸乳的潜力

2.2.1凝乳时间

将筛选到的7株菌与对照菌株保加利亚乳杆菌都用于酸乳发酵后，发现样品在6 h都出现部分凝乳，7 h都完全凝乳，并未出现显著差异。

图1　菌株在酸溶液、胆盐溶液、人工模拟胃液、人工模拟胰液中的存活率Fig.1　The survival rate of lactic acid bacteria strains inacid solution, bile solution, simulating gastric juice andsimulating intestinal fluids

2.2.2感官评价结果

感官评价是酸乳品质测评的重要手段，将这7株菌株与对照菌保加利亚乳杆菌(CK)用于酸乳发酵后，对质地、气味和口感方面进行评价，对照菌保加利亚乳杆菌发酵的酸乳(CK)得分达到了90分，与我们筛选菌株有显著差异，保加利亚乳杆菌做为长期筛选稳定的工业菌株，其酸乳发酵特性非常优良。7株供试菌中，达到80分以上的有5株菌， 2株菌得分70～80分之间(银川1、新B4)。选择80分以上的“鲜豆腐8”、“新E6”、“克1”、“新A22”、“新E10”等5株菌作为后续试验供试菌株(表2)。

表2　菌株发酵酸乳感官评价得分Tbale 2　Sensory evaluation scores on yoghourt fermentedwith lactic acid bacteria strains

注：小写字母表示0.95水平检验。

酸乳持水力大小指酸乳保质期内乳清析出的多少，反映不同质地酸乳对乳清的截留能力，越大表示酸乳质地越优。6株菌持水力值均在在10%～50%之间，对照(CK)的持水力为28.99%，其中最大的为“克1”，达到了35.31%，其余“新A22”、“新E6”、“鲜豆腐8”、“新E10”等4株菌发酵酸乳差异不显著，但均比对照(CK)显著小(图2)。

图2　菌株发酵酸乳持水力Fig.2　Holding water capacity of yoghourt fermentedwith lactic acid bacteria strains注：小写字母表示0.95水平检验。图3、图4、图5、图6.

2.2.3质构分析结果

感官评价法一般采用暂时的评分系统，局限性很大，而且这种评定费时费力，受评价员的情绪、健康状况等多种因素影响，稳定性不足。质构仪通过模拟人的口腔咀嚼功能，用具体的数据，客观地将人的触觉感受分解成硬度、咀嚼性、弹性、内聚性、胶黏性等几个部分，5株菌发酵酸乳样品质构数据如图3～图5所示。

图3　菌株发酵酸乳破裂力、内聚力、咀嚼性测定结果Fig.3　Rupture force, cohesiveness and chewiness of yoghourtfermented with lactic acid bacteria strains

图4　菌株发酵酸乳胶黏性、最大黏附力、硬度Fig.4　Tackiness, the maximum adhesion force and hardnessof yoghourt fermented with lactic acid bacteria strains

图5　菌株发酵酸乳弹性Fig.5　Elasticity of yoghourt fermented with lactic acidbacteria strains

破裂力反映了样品表面脆性，通过测定这5株菌发酵酸乳的破裂力，菌株“新E6”、“新E10”发酵酸乳的破裂力较大，和对照(CK)差异性不显著；内聚力反映了模拟咀嚼样品时，样品抵抗受损、紧密连接，试图保持完整的能力，结果显示菌株“新E6”发酵酸乳的内聚力最大，与对照(CK)差异性不显著，而其他4株发酵酸乳内聚力显著低于对照(CK)和菌株“新E6”发酵酸乳；咀嚼性反映了入口后的整体口感，对照(CK)最高，菌株“新E6”发酵酸乳的咀嚼性次之；胶黏性等于硬度与凝聚性的乘积，用于描述半固态物质的特性，结果显示菌株“新E6”发酵酸乳的胶黏性是最大的，高于对照(CK)；而在反映了样品在被模拟口腔咀嚼时，对上腭、牙齿、舌头等接触面黏着的性质的最大粘附力中，菌株“新E6”与“新E10”发酵酸乳的最大粘附力较大，但略低于对照(CK)，其他3株菌最大粘附力较小；硬度反映了酸乳凝固强度，对照(CK)也是最高，菌株“新E6”发酵酸乳次之；弹性反映了试样如果受到彻底挤压，在一段时间内变形恢复的能力，结果显示5株菌发酵酸乳弹性无显著差异且低于对照(CK)。综合7个质构指标，对照(CK)大部分指标较优，菌株“新E6”发酵酸乳次之。

2.2.4黏度测定结果

通过黏度计来测定5株菌发酵酸乳粘度，各现菌株间的黏度差异显著(图6)，对照酸乳(CK)的黏度最大，达到了5 984 mPa·s，菌株“新E6”发酵酸乳黏度次之，达到了5 565 mPa·s，菌株“新E10”发酵酸乳黏度最小，只有1 113 mPa·s。

图6　菌株发酵酸乳粘度Fig.6　Viscosity of yoghourt fermented with lactic acidbacteria strains

2.2.5滴定酸度和后酸度检测结果

发酵结束后酸乳，滴定酸度要适中，发酵7 h后的样品，菌株“鲜豆腐8”发酵酸乳酸度最高，菌株“新E6”发酵样品和对照(CK)无显著差异，其余3株菌发酵酸乳滴定酸度较低；冷藏保存7d后，菌株“新E6”发酵样品和对照(CK)的后酸变化较小，显著低于其他4株菌发酵的酸乳(表3)。

2.3　“新E6”菌株分子生物学鉴定

综合各个指标，菌株“新E6”发酵酸乳各方面较优，因此，“新E6”菌株既对胃肠道环境耐受性较强，同时应用在酸乳发酵中潜力也较大。“新E6”菌落灰白不透明、表面光滑，显微镜下细胞球形或卵圆形，成对或短链(图7)。提取该菌株基因组DNA，采用PCR扩增16S rDNA序列。测序后获得约1 500 bp序列，将该序列在Ezbiocloud中比对，结果显示“新E6”的16S rDNA序列与EnterococcusduransNBRC 100 479(Type)的16S rDNA序列相似度高达99%，用该序列和Enterococcus属其他种的16S rDNA用ML法构建系统发育树上，显示“新E6”与坚强肠球菌(E.durans)聚在一起(图7)，因此，“新E6”分类地位属坚强肠球菌(E.durans)菌株。

表3　菌株发酵酸乳滴定酸度Table 3　Titratable acidity of yoghourt fermented withlactic acid bacteria strains

注：小写字母表示0.95水平检验

图8　基于16S rDNA用ML法构建Enterococcus属系统发育树Fig.8　The phylogenetic tree of genus Enterococcusbased on 16S rDNA sequences

3　讨论

益生菌通过人体胃部，到达肠道部位，黏附于肠道上皮细胞，从而实现定植，发挥对人体或动物宿主的有益功效。胃液和肠液构成人体的“生物屏障”，益生菌必通过胃肠道后幸存下来，才能在体内发挥它的益生功能。食物通过胃的时间一般为1～3 h，通过小肠的时间约为1.5 h[26]。本实验选取了4 h作为耐受性测试时间，大于食物在胃肠道中通过时间，其筛选菌株耐受时间一定满足人体自然胃肠道要求。

pH值是影响微生物生长一个重要因素，所以益生乳酸菌的理想特性包括其酸性条件下耐受力。胃液酸性很强，空腹时pH值为0.9～1.8，受食物酸性的影响，进食过程中pH值在1.8～5.0波动，通常pH值维持在3.0左右[27]。因此，耐受pH 3.0是乳酸菌重要益生特性，本试验设计在pH 3.0酸性条件下研究分离株的耐酸性能。结果表明，大多数乳杆菌分离株在pH 3.0酸性条件下培养4 h活力减少50%以上，酸性条件对菌株有明显抑制或杀灭作用。

由于胆盐会瓦解细胞膜结构并导致膜蛋白解离，使细胞内容物渗漏，导致细胞死亡。因此，耐胆盐能力被认为是乳酸菌能否在人体胃肠道定殖、生长、代谢，并发挥生理功能的重要指标。在肠道内胆盐浓度不是一成不变的，在第1 h内，胆盐浓度在1.5%～2%，最后降低到约0.3%。研究表明，健康人体肠道最大胆盐浓度为0.3%，0.3%胆盐浓度被认为是耐胆盐菌株的筛选临界浓度[28]。本项目以0.3%牛胆汁中处理4 h进行筛选菌株胆盐耐受特性研究，选出的大多数乳酸菌分离株表现出对胆盐的较强耐受力。

胃肠道除酸碱极端外，还含有各种酶类(主要是胃蛋白酶和胰蛋白酶)，相比对胃蛋白酶的影响，本研究中大多数分离菌株耐受胰酶溶液。供试菌株在模拟胰液中培养4 h，表现相对高的存活率，细胞数减少均较小，甚至没有减少反而增加，说明肠道中杀死外来菌的主要是胆盐而不是胰蛋白酶。这一结果与张丽[15]和CHARTERIS等[29]研究报道一致。

益生乳酸菌发挥益生作用的前提必须是到达人体肠道并定植后才能发挥其生理功效，而人们日常摄入乳酸菌途径主要是通过食用各种发酵乳制品和口服乳酸菌制剂，这样进入人体的乳酸菌必然要经过消化系统的考验。对胃肠道耐受性分析只是益生菌筛选的第一步，益生菌要求特性还有许多。另外，实验筛选的胃肠道耐受能力和酸乳发酵能力均较优的菌株“新E6”为坚强肠球菌(E.durans)，它不属于国家批准可用于食品的菌种。因此“新E6”如果要开发为益生菌，后续试验还需进行菌耐药性、抗肠道病原菌活性、黏膜细胞黏附性、安全性等特性深入研究。

实验筛选的胃肠道耐受能力和酸乳发酵能力均较优的菌株“新E6”，在胃肠道耐受性方面明显优于对照，在酸乳发酵性能方面，并没有表现得比对照菌株保加利亚乳杆菌显著优良，甚至在某些方面弱于对照菌。其原因可能由于商业化工业用保加利亚乳杆菌是经过多年选育而成，在酸乳发酵方面的表现稳定而优秀，“新E6”属于自然分离菌，并未经过选育，并且分类属肠球菌属，该属内菌株酸乳发酵性能整体不如保加利亚乳杆菌所在的乳杆菌属(Lactobacillus)。

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