王军 赵思语 欧阳少波 廖岚

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身肿瘤的第九位，且近年来呈增高趋势［1］。因其具有早期诊断难、易发生淋巴结转移且预后差等特点，5年整体生存率仅为50%左右［2］。目前其诊断主要依靠临床检查和组织活检，且因患者就诊时往往已处于癌症中晚期，影响疗效。另外一些血浆肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖链抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9），对口腔鳞癌早期诊断的敏感性和特异性尚不明确［3］。因此，寻找敏感度高和特异性强的肿瘤标志物是近年来口腔鳞癌研究的热点。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸、不具有蛋白质编码功能的RNA［4］。近年研究表明，lncRNA的表达失调与肿瘤的复发、转移及预后密切相关［5］。同时，研究发现lncRNA能够稳定存在于外周血中，其检测对于疾病诊断及判断预后具有重要意义［6］。肺腺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）是最早发现的 lncRNA之一，与多种恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移密切相关［7－8］。已有研究表明MALAT1在口腔鳞癌组织中异常表达，可能参与口腔鳞癌的发病过程［9－10］，然而尚未见有关其在口腔鳞癌血浆中表达的报道。本研究旨在检测MALAT1在口腔鳞癌患者血浆中的表达水平，分析其与口腔鳞癌临床病理特征之间的关系，并探讨其在口腔鳞癌诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015-01～2017-01在南昌大学第二附属医院口腔颌面外科收治的口腔鳞癌患者70例，其中男42例，女28例，年龄37～73岁，中位年龄52岁。口腔鳞癌患者均为初次确诊，术前均未进行过化疗、放疗、生物治疗及中西医结合治疗，且无合并其他肿瘤、高血压、糖尿病、感染性疾病及免疫系统疾病。鳞癌原发灶及颈淋巴结转移灶均经由组织病理确诊。详细记录肿瘤部位、大小、TNM分期、病理分级及淋巴结转移等参数。并采集15例患者术后30 d静脉血用于比较手术前、后血浆MALAT1变化。选取同期南昌大学第二附属医院健康体检者作为对照组，共50例，男性28例，女22例，年龄34～75岁，中位年龄50岁。健康对照人群无口腔黏膜疾病，且无肿瘤、高血压、糖尿病、感染性疾病及免疫系统疾病。口腔鳞癌组及健康对照组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究已通过南昌大学第二附属医院伦理委员会的批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

实时荧光定量PCR仪（7500型 ABI，美国）；Trizol LS试剂（Invitrogen，美国）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和 SYBR®Premix Ex TaqTM（大连宝生物TaKaRa公司）；荧光定量PCR引物（上海生工生物工程技术有限公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集 清晨分别采集口腔鳞癌组和健康对照组外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，并尽快进行血浆分离，即4℃1 000 g，离心10 min，吸取上清液至EP管，－80℃冻存备用。

1.3.2 血浆总RNA的提取及cDNA合成 按Trizol LS试剂说明书提取血浆样本总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。采用分光光度仪检测总RNA浓度和质量。检测合格后取1μl RNA，采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser逆转录获得互补脱氧核糖核酸（cDNA）。

1.3.3 实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）反应 采用SYBR法进行RT-qPCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。内参GAPDH上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；MALAT1上游引物为：5′-CTTAAGCGCAGCGCCATTTT-3′，下游引物为 5′-CCTC CAAACCCCAAGACCAA-3′。以20μl反应体系进行检测。反应体系为：1×SYBR Green Imaster-mix、0.5 μmol／L特异前向引物、0.5μmol／L特异反向引物、1 μl反转录产物。反应条件为：95℃预变性 10 min后，95℃15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，共40循环。所有样品做3复孔。根据待测标本的Ct值，以GAPDH为内参，采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析，以2－△△Ct表示口腔鳞癌血浆目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析。采用Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验对数据进行正态分布检验，结果以±s表示，两样本均数比较用t检验，手术治疗前后患者血浆MALAT1表达水平比较采用配对t检验，多组间的比较采用ANOVA方差分析。采用GraphPad Prism 5软件，以敏感度为纵坐标，1-特异度为横坐标绘制口腔鳞癌组和健康对照组相比较的受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC），并计算曲线下面积（area under of ROC curve，AUC）评估血浆MALAT1的诊断效能。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 口腔鳞癌患者与健康对照组血浆MALAT1表达水平的比较

采用RT-qPCR技术检测受试者血浆中MALAT1的表达水平，结果显示，口腔鳞癌患者血浆中的MALAT1的相对表达量（2.12±1.18）高于健康对照组（1.02±0.44）（t＝5.84，P＜0.001）。

2.2 口腔鳞癌患者血浆MALAT1的表达与临床病理特征的关系

分析血浆MALAT1的表达与口腔鳞癌患者临床病理特征（年龄、性别、肿瘤类型、肿瘤大小、肿瘤分化程度、有无淋巴转移及TNM分期等）之间的关系。结果表明，血浆MALAT1的相对表达量与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05）（表 1）。

表1 口腔鳞癌患者血浆MALAT1表达水平和临床病理参数的相关性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

表1 口腔鳞癌患者血浆MALAT1表达水平和临床病理参数的相关性（±s）Tab 1 The relationship between the expression of plasma MALAT1 and its clinicopathologic features of OSCC（±s）

临床病理参数 n 血浆MALAT1的表达量 P值性别 男45 1.99±0.18 ＝0.610女25 2.16±0.23年龄（岁） ≤50 22 1.89±0.19 ＝0.445＞50 48 2.14±0.18肿瘤类型 舌癌 33 2.28±1.29 ＝0.142牙龈癌 18 1.49±0.50颊黏膜癌 10 2.13±1.02腭癌 5 2.26±1.99唇癌 4 2.31±1.23肿瘤大小 T1 17 2.08±0.93 ＝0.558 T2 31 1.91±1.30 T3 10 1.95±0.59 T4 12 2.48±1.54 TNM分期 Ⅰ＋Ⅱ期 47 1.74±0.89 ＝0.005Ⅲ ＋Ⅳ期 23 2.69±1.46肿瘤分化程度 中、高分化 56 1.88±0.92 ＝0.016低分化 14 2.75±1.80颈淋巴结转移 无 53 1.76±0.88 ＝0.001有17 3.03±1.83

2.3 手术治疗前后口腔鳞癌患者血浆MALAT1表达水平变化

对15例成功接受口腔鳞癌手术治疗的患者手术前后血浆MALAT1水平进行监测，结果显示，术后30 d血浆 MALAT1表达（1.16±0.56）与术前（2.68±1.35）相比显著降低（P＜0.001）（图 1）。

2.4 血浆MALAT1在口腔鳞癌患者中的诊断价值

采用ROC曲线评估血浆MALAT1作为口腔鳞癌生物标记物的诊断价值，结果显示，血浆MALAT1诊断口腔鳞癌 ROC的 AUC为 0.814（95%CI：0.738－0.891；P＜0.001），具有较好的诊断效果，以 1.18为临界值，血浆MALAT1鉴别口腔鳞癌和健康对照的敏感度和特异度分别为87.43%和72.00%（图2）。

3 讨 论

图1 口腔鳞癌患者手术前后血浆中MALAT1表达水平Fig 1 Relative expression levels of plasma MALAT1 between preand post-operation samples

图2 血浆MALAT1诊断口腔鳞癌的ROC曲线Fig 2 Receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of plasma MALAT1 for the discriminative ability of OSCC patients vs healthy controls

口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的的恶性肿瘤之一，包括吸烟在内的多种因素可以导致口腔鳞癌的发生发展，但其具体病因尚未明确［11］。尽管现在包括手术、放疗和化疗等在内的治疗技术已经取得长足进步，但是由于口腔鳞癌患者早期常无明显症状不易引起重视，造成确诊时患者往往已处于肿瘤进展期或晚期，导致患者的5年生存率几乎没有提高［12］。早诊断早治疗能够大大提高口腔鳞癌患者的预后生存期，但由于口腔活组织病理学检查具有有创性且操作复杂，并可能造成癌细胞的扩散，不适用于大量人群的筛查。因此，迫切需要探寻一种更加有效的肿瘤标记物用于口腔鳞癌的早期诊断。

越来越多的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰和核内运输等多种重要的调控过程，在许多疾病的发生发展中具有重要的作用［13］。同时研究发现，lncRNA广泛存在于外周血中，如血清、血浆等，且循环lncRNA可以稳定存在于循环系统中［14］。近年来，人们发现肿瘤患者体内循环lncRNA的表达与正常人存在差异，并随着肿瘤的发展而具有特异性变化，是肿瘤诊断潜在的生物学标志物［15－16］。例如，Wang等［17］发现食管癌患者血清中HOTAIR表达显著上调，ROC分析结果显示HOTAIR诊断食管癌的曲线下面积为0.793。Zhou等［18］研究发现胃癌患者血浆中H19表达异常，对胃癌的诊断具有一定价值。已有研究报道了在口腔鳞癌病变组织中存在诸多异常表达的lncRNA，如HOTAIR［19］、UCA1［20］等。目前尚未见有关循环 lncRNA在口腔鳞癌中的研究报道。

MALAT1最早在非小细胞肺癌的研究中被发现，全长6 700 bp，位于染色体11q13.1，是lncRNA家族的重要成员之一。大量研究证实MALAT1可通过调节上皮间质转化、发挥竞争性内源性信使RNA作用或参与表观遗传调控以及细胞周期调控［21］，促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。其被发现在多种肿瘤中表达上调，如结肠癌、肝癌、乳腺癌等［22］。在口腔鳞癌研究中，Zhou等［9］发现在口腔鳞癌癌组织中MALAT1表达显著上调，并且高表达的MALAT1可以通过诱导上皮间质转化促进肿瘤的生长及转移。本研究着重探讨MALAT1在口腔鳞癌患者血浆中表达水平的变化及其是否可作为口腔鳞癌诊断的可靠生物标志物。

本研究通过RT-qPCR技术对70例口腔鳞癌患者及50例健康对照者血浆MALAT1的表达水平进行检测，结果发现MALAT1在口腔鳞癌血浆中表达显著上调，且MALAT1的相对表达量与分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关。15例接受口腔鳞癌手术治疗的患者术后30 d血浆中MALAT1表达水平显著降低，提示术后监测血浆 MALAT1表达水平或有助于监测口腔鳞癌的疗效和预后。ROC曲线分析显示血浆MALAT1诊断口腔鳞癌的ROC曲线下面积为0.814，提示其可作为诊断口腔鳞癌的的有效标识。

需要指出的是，由于本研究收集样本的时间较短，未对口腔鳞癌患者长期随访以观察疾病进展和生存预后情况，因此未能分析血浆中MALAT1的表达与患者生存率之间的相关性。在下一步研究中，将在扩大样本量的同时对口腔鳞癌患者进行定期随访，以进一步分析血浆中 MALAT1的表达值在口腔鳞癌患者预后判断中的意义。

综上，本研究结果表明血浆MALAT1在口腔鳞癌患者中表达显著上调，并且其表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移显著相关，有望成为口腔鳞癌早期诊断及疗效监测的潜在生物标记物。

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