霍雪萍，张琳萍，赵向绒，刘勤社，王海芳

1.陕西省人民医院 中心实验室，陕西 西安710068；2.西安交通大学 医学部中西医结合专业，陕西 西安710061；3.陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室，陕西中医药大学，陕西 西安712046

WST-1 是一种快速高灵敏度检测试剂，广泛用于细胞因子等诱导的细胞增殖变化检测、抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，以及评价药物对细胞损伤模型的保护作用。WST-1检测具有线性范围宽、灵敏度高、溶解性强、操作方便等特点。

已有研究表明，细胞接种密度不合适可能影响细胞增殖及毒性研究结果。管莹等[1]利用细胞倍增实验对CHO 细胞不同接种密度下48 h 内的细胞倍增时间进行测定，以2×104～6×104/mL 的初始密度接种细胞，细胞在连续48 h 的培养时间内生长速度较为稳定；而以较高密度8×104～10×104/mL 接种细胞，由于生长空间有限，当细胞达到饱和密度后，细胞间的接触抑制作用导致细胞增殖减慢，细胞停止生长。孙大勇等[2]证明二氢杨梅素对A549 细胞的抗肿瘤作用与给药时的细胞密度有关，细胞密度越低，药物的抗肿瘤作用越强，提示细胞生存能力与细胞密度有关。李光宗等[3]也提出小鼠细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK 细胞）的初始接种密度为8×106时有利于细胞增殖、分化及杀瘤作用的形成，增加细胞密度到12×106时，细胞因过于拥挤导致生长空间相对不足而大量死亡。由此可见，合适的细胞初始接种密度是保证增殖及毒性试验顺利完成的基础，而接种密度的选择与所用细胞类型、实验目的及预计药物作用都有关系。本实验室在研究药物对血管内皮细胞增殖的影响，以及评价药物对H2O2诱导细胞氧化损伤的保护作用时发现，细胞增殖与毒性试验定量检测所得到的结果常常存在较大差异，有时甚至出现药物作用趋势的根本不同。鉴于此，我们检测了不同细胞初始接种密度对体外培养的小鼠脑血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，bEND.3）药物促增殖作用及H2O2诱导氧化损伤的影响，为建立可靠的血管内皮细胞增殖及损伤和药物作用评价实验体系探索合适的细胞密度条件，为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

bEND.3 小鼠脑微血管内皮细胞（上海拜力生物科技有限公司）；RPMI-1640 细胞培养基和胎牛血清（Clontech 公司）；WST-1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞培养用青霉素/链霉素和胰蛋白酶（碧云天生物技术研究所）；活血胶囊（西安大唐制药集团有限公司，批号：B20020336）；30%双氧水（天津市广成化学试剂有限公司）；96 孔细胞培养板（Thermo Fisher 公司）；CO2细胞培养箱（Napco 公司）；倒置光学显微镜（Olympus 公司）；Model 680 型酶标仪（Bio-Rad 公司）。

1.2 活血胶囊（HXJN）水溶液配制

称取0.9 g 活血胶囊颗粒，研细，加入6 mL无血清RPMI-1640 培养基，搅拌使之充分溶解，2000 r/min 离心5 min，吸取溶液上层，0.22 μm微孔滤膜过滤分装，-80℃冰箱保存。

1.3 细胞培养

bEND.3 细胞贴壁生长于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640 培养液中，在37℃、5% CO2及饱和湿度的恒温密闭细胞培养箱内培养，0.025%胰蛋白酶消化传代，每2 d 传代1 次，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 倒置显微镜观察

取对数生长期的bEND.3 细胞，胰酶消化，吹打均匀，细胞计数后分别以细胞密度为1500、3000、6000、10 000/孔接种于96 孔细胞培养板，每孔加入200 μL 完全培养液，置培养箱中培养，药物处理前观察细胞形态并拍照。

1.5 细胞增殖实验

采用WST-1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测不同细胞接种密度、不同浓度活血胶囊溶液对bEND.3 细胞增殖能力的影响。简述之，取对数生长期细胞，分别以1500、3000、6000/孔的细胞密度接种于96 孔细胞培养板培养过夜。次晨按照空白对照组和药物组处理，药物组加入HXJN溶液，使其终浓度分别为300 和750 μg/mL，每个浓度设6 个复孔，每孔200 μL 溶液，分别作用细胞24、48 和72 h，之后每孔换为事先配好的WST-1 溶液100 μL，在细胞培养箱内继续孵育1～2 h，充分混匀待检测体系，测定D450nm值。

1.6 氧化应激损伤模型

取对数生长期细胞，分别以6000 或10 000/孔的密度接种于96 孔细胞培养板，每组6 个复孔，培养过夜。次日按空白对照组与药物组处理，药物组加入90 μL H2O2溶液，使终浓度分别为100、200 和300 μmol/L，作用2～2.5 h，之后每孔加入10 μL WST-1 溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，充分混匀待检测体系，测定D450nm值。

1.7 统计学方法

从Model 680 型酶标仪中导出D450nm值，用Ex⁃cel 软件进行统计学分析，数据采用x±s表示，单因素方差分析计算P值，P＜0.05 为具有显著性差异。

2 结果

2.1 不同接种密度对细胞形态的影响

倒置显微镜下观察内皮细胞形态（图1）。接种密度为1500/孔时，细胞呈多角形或不规则形，散在生长，细胞间空隙较大，互相之间基本无接触；接种密度为3000/孔时，部分细胞形态较为规则呈梭形，细胞之间开始发生连接；接种密度为6000 和10 000/孔时，随细胞密度的增高，细胞形态更加规则，大多呈梭形，密集处呈明显的铺路石状生长，细胞之间相互连接、密集成片生长。

2.2 不同接种密度对细胞增殖的影响

据统计96 孔细胞培养板内细胞长满时约为1×105个。按照细胞在接种后24 h 进入对数生长期计算，细胞的初始接种密度最大为6000/孔，培养72 h 可长满。如图2 所示，细胞初始接种量为1500/孔时，与空白组相比，HXJN 组在24 和48 h检测D450nm值无升高，且随药物浓度增加和时间延长，对细胞增殖有一定的抑制作用；然而在72 h时检测，药物显示出一定的促增殖作用。细胞初始接种量为3000/孔时，在24 h 检测D450nm值升高不明显，而48 和72 h 时HXJN 组显示显著的促增殖作用，但不同剂量组之间作用无显著差异。细胞初始接种量为6000/孔，在24 h 检测时药物作用不明显，48、72 h 检测发现药物促增殖作用明显升高，且显示出一定的剂量-效应关系。

2.3 不同细胞接种密度对H2O2诱导细胞氧化损伤的影响

如图3，随细胞接种量的不同，H2O2对细胞产生氧化损伤的程度存在明显差异。细胞初始接种量为6000/孔时，H2O2浓度为100 μmol/L 可引起显著的细胞损伤，细胞存活率为50%左右；H2O2浓度为200 和300 μmol/L 时，细胞受损严重，细胞形态发生明显变化，几乎全部呈脱落、漂浮和破碎状态。细胞初始接种量为10 000/孔时，100 μmol/L H2O2浓度下细胞仍贴壁生长良好；H2O2浓度为200 μmol/L 时，细胞形态发生变化，变圆、皱缩、破碎和脱落漂浮现象明显，细胞存活率为50%左右；300 μmol/L 时，培养液中死亡细胞数目增多，大多数细胞呈脱落、漂浮和破碎状态，存活率仅为25%左右。

图1 不同接种密度下的细胞形态（×100）

图2 不同初始接种密度对HXJN促细胞增殖作用的影响

图3 不同初始接种密度对H2O2诱导细胞氧化损伤的影响

3 讨论

我们用WST-1 试剂检测中药复方HXJN 对bEND.3 血管内皮细胞的72 h 促增殖作用，结果表明药物对bEND.3 细胞具有显著的促增殖作用，而细胞初始接种密度是影响实验结果的重要因素。细胞接种密度为1500/孔时，药物的促增殖作用不明显；接种密度为3000 和6000/孔时，可见显著的药物促增殖作用，并可观察到剂量-效应关系。适宜的初始接种密度是观察细胞增殖作用的先决条件，密度过高或过低均不利于观察药物的促增殖作用。

在构建H2O2诱导bEND.3 细胞氧化损伤模型时，选定合适的初始接种密度同样重要。我们的结果显示，初始接种量为6000/孔，100 μmol/L H2O2作用2 h，细胞存活率约为50%；而当初始接种量为10 000/孔时，200 μmol/L H2O2作用下细胞的存活率约为50%。这提示由于细胞初始接种密度不同，导致同一浓度H2O2对血管内皮细胞的损伤程度显著不同。因此，在进行氧化损伤和药物筛选、作用机制研究时，须通过预实验选定合适的细胞接种密度并在整个研究过程中保持一致，才能确保实验结果的准确性和稳定性。

细胞接种密度较大时，细胞间连接增加，可能通过某种机制影响细胞之间的信号传递，影响细胞的增殖和抗氧化损伤能力。血管内皮细胞间连接主要有4 种类型，即缝隙连接、紧密连接、黏附连接和黏合体，而黏附连接是主要的连接，紧密连接和缝隙连接穿插于黏附连接之间，但细胞间小分子通讯的通道主要还是缝隙连接[4]。陈志从等[5]通过细胞分子水平验证丹参酮ⅡA 参与增强上皮细胞缝隙连接通讯的功能，有利于提高药物的增殖能力及抗氧化损伤能力。除此之外，细胞密度对于基因转染效率[6]、成骨细胞分化[7]和细胞衰老[8]等许多其他类型的实验研究也有显著影响，例如应激性细胞衰老必须在非长满的状态下进行研究，否则会使背景信号大大增强。因此，细胞接种密度不仅是实验研究中一个值得注意的重要问题，也是细胞间信号传递研究中一个令人感兴趣的课题。