王强，段云飞，徐燕，张超，冷晓燕

江苏迈健生物科技发展股份有限公司，江苏 无锡214000

表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是人体内的一种活性多肽，由53 个氨基酸残基组成，相对分子质量约为6.2×103。EGF 的最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞[1]。EGF 还能止血，并具有加速皮肤和黏膜创伤愈合、消炎镇痛、防止溃疡的功效。20 世纪80年代以来，随着基因重组技术的发展，人们开始进行重组人EGF（recombi⁃nant human EGF，rhEGF）的大规模生产尝试[2]。迄今，hEGF 基因已被克隆并在多种系统中得到表达，但表达量偏低，生物活性普遍不高，难以实现大规模工业化生产[3-4]。我们通过改变hEGF 基因的cDNA 结构，同义密码子置换核苷酸序列中个别基因的碱基，选择一种密码子偏好性最优的rhEGF 优化序列构建原核表达载体，使其在大肠杆菌宿主中能够得到高水平的表达。这对于hEGF 产业化高效制备及应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c3T3 细胞购自中国科学院细胞库；大肠杆菌BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司；表达载体pET30a 由军事医学研究院放射与辐射研究所馈赠；hEGF 标准品购自上海普欣生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid 公司；MTT 购自北京索莱宝科技有限公司；亲和色谱填料购自常州天地人和生物科技有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯产品。

1.2 rhEGF基因序列优化

根据密码子的兼并性，在hEGF 活性肽氨基酸排列顺序不变的情况下，采用生物软件Vector NTI Suitor 7.0 分 析hEGF核酸序列（GenBank，ID1950），对hEGF 进行基因改造优化，将hEGF 原基因序列中大肠杆菌稀有密码子改成偏好密码子，以提高目的基因在大肠杆菌中的高水平表达，同时5′端加人PelBL 信号肽序列，有助于提高蛋白表达量和可溶性，3′端融合His 标签，可方便后期纯化，设计合成hEGF 全长序列。

1.3 rhEGF基因克隆与诱导表达

对合成的含rhEGF 全序列的载体pUC-rhEGF用限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切过夜，琼脂糖胶回收酶切后的小片段，与同样经双酶切的表达载体pET-30a 在T4DNA 连接酶的作用下于16℃过夜连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α 后，挑选阳性克隆，提取质粒，送上海生工公司测序，取测序结果同预期结果完全一致的菌落保存。将携带hEGF 序列的原核表达载体命名为pET-30a-rhEGF。

将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3)，挑选阳性克隆，将构建好的工程菌接种到加有卡那霉素的LB 培养基中，于摇床中37℃过夜培养，次日以1∶100 的比例接种到200 mL 新鲜的含卡那霉素的LB 培养基中，4～5 h 后菌液的D600nm值达0.6 以后，加入诱导剂IPTG 至终浓度为0.5 mmol/L，37℃诱导4 h，离心，收集菌体沉淀，重悬于30 mL 含1 g/L 溶菌酶的PBS 中，混匀后4℃过夜酶解，超声波破碎，离心，收集沉淀和上清，进行15% SDS-PAGE，分析目的蛋白在原核系统内的表达量和表达形式。

1.4 rhEGF包涵体的纯化和复性

电泳鉴定rhEGF 以包涵体形式存在。收集包涵体沉淀，用1% Triton X-100 洗涤3 次，4℃、12 000 r/min 离心收集沉淀，用含尿素的缓冲液（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH8.0）于4℃溶解过夜，保证沉淀得到最大程度地溶解。取溶解后的上清过Ni 亲和层析柱，先用平衡缓冲液（8 mol/L 尿 素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH8.0）平衡Ni 柱，上样结束后用洗涤缓冲液（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH6.3）洗涤Ni 柱，最后用洗脱缓冲液（8 mol/L 尿素，0.1 mol /L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH4.0）洗脱样品。将Ni 柱纯化的rhEGF 加入复性液（0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol /L Na2HPO4，3 mmol/L 还原型谷胱甘肽，0.3 mmol/L 氧化型谷胱甘肽，5%甘油，pH8.0）至终浓度约为0.1 g/L，此时尿素浓度为0.8 mol/L，在4℃条件下复性并不断搅拌，复性16 h，复性完成后复性液用G25 凝胶柱脱盐，并洗脱至PBS 缓冲液中，用超滤浓缩管进行超滤浓缩获得最终样品。

1.5 rhEGF的相对分子质量、纯度与活性检测

参照2015年版《中国药典》，用还原型SDSPAGE 测定相对分子质量，分离胶浓度为17.5%，加样量不低于1 μg（考马斯亮蓝R250 染色法）。经扫描仪扫描，相对分子质量应与对照品相近。

参照2015年版《中国药典》，用非还原型SDS-PAGE 测定纯度，分离胶浓度为17.5%，加样量不低于10 μg（考马斯亮蓝R250 染色法）。经扫描仪扫描，计算得纯度。

参照2015年版《中国药典》，用高效液相色谱法测定纯度，使用C18柱，以A 相（三氟乙酸-水溶液：量取1 mL 三氟乙酸加水至1 L）、B 相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1 mL 三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1 L）为流动相，在室温条件下进行梯度洗脱（0～70% B 相），上样量不低于10 μg，在波长280 nm 处检测，以hEGF 色谱峰计算的理论塔板数不低于500，按面积归一化法计算纯度。

参照2015年版《中国药典》，用BALB/c3T3 细胞增殖/MTT 比色法测定活性。BALB/c3T3 细胞用RPM1640 培养基培养，将对数生长期的细胞按5×103/孔加入96 孔细胞培养板，24 h 后更换成含0.4%胎牛血清的RPM1640 培养基继续培养24 h，依次加入用维持培养液稀释的不同浓度的EGF样品，做8 个浓度梯度，梯度之间1/4 稀释，每浓度梯度做3 个平行孔，37℃、5% CO2条件培养72 h，MTT 法检测各孔的D570nm和D630nm值，采用四参数回归计算法计算rhEGF 的活性。

2 结果

2.1 rhEGF表达载体构建

用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切含rhEGF 全序列的载体pUC-rhEGF，回收酶切后的小片段，通过连接酶克隆到表达载体pET-30a 中，筛选阳性克隆，提取质粒pET-30a-rhEGF，经NdeⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，10 g/L 琼脂糖电泳结果显示酶切后生成的条带约为250 bp（图1）。将重组质粒测序，结果证明所构建的表达载体基因的核苷酸序列与设计序列一致（图2）。

图1 pET-30a-rhEGF 双酶切产物的琼脂糖电泳

图2 基因测序图谱分析

图3 rhEGF 原核表达形式的SDS-PAGE 分析

图4 rhEGF 纯化后SDS-PAGE 分析

2.2 rhEGF的原核表达

取测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），将重组菌接种至含卡那霉素的LB 培养基中，37℃振荡培养，菌液D600nm值约为0.6 时加入IPTG 诱导表达4 h，离心收集沉淀，超声波破碎，15% SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量和表达形式，结果如图3。诱导后rhEGF 明显表达，且基本以包涵体的形式存在于超声波破碎后的菌体沉淀中，增加信号肽并没有显著提高rhEGF 的可溶性，但由于信号肽在表达过程中被切除，未对rhEGF 的相对分子质量产生明显影响，而在后期的生物活性鉴定中表现出高于对照品的较高的活性，所以仍保留了信号肽序列。

2.3 包涵体蛋白的纯化和复性

用Triton X-100 洗涤包涵体，除去脂类和降解的核酸，然后用8 mol/L 尿素溶解。取变性后的上清液过Ni 亲和层析柱，由图4 可以看到，经Ni 柱纯化后，杂蛋白基本被去除，只显示相对分子质量6.5×103左右的单一蛋白条带，一步纯化的纯度可达90%以上。对洗脱上清稀释复性，整个复性过程均没有沉淀产生。

2.4 电泳法测定rhEGF的相对分子质量

取最终浓缩的rhEGF 样品进行SDS-PAGE 检测，结果如图5。由于rhEGF 融合有His 标签，相对分子质量略大于对照品，约为6.5×103。

2.5 电泳法和高效液相色谱法测定rhEGF纯度

取最终浓缩的rhEGF 样品进行非还原SDSPAGE，结果如图6，经Image J 软件扫描纯度可达96.8%。取最终浓缩的rhEGF 样品，用高效液相色谱法测定纯度，按面积归一化法计算得纯度为92.8%（图7）。

2.6 MTT法测定rhEGF活性

按照药典附录XH，采用细胞增殖法/MTT 比色法测定活性。培养72 h 后去除上清，每孔加入100 μL DMSO，用酶标仪振荡96 孔板并测定D570nm和D630nm值，结果如表1。分别将rhEGF 标准品及样品蛋白浓度对各自的吸光值做图，在0～16 μg/L 浓度范围内进行四参数回归计算（图8）。标准品及样品的方程分别为y=（0.75021-0.53151）/［1+（x/0.05088）-0.34732］+0.53151、y=（0.67033-0.43905）/［1+（x/0.00171）-0.57661］+0.43905，相关系数（R2）分别为0.99407 和0.99310。采用四参数回归计算法处理数据，并按下式计算结果：

式中，Pr为标准品生物学活性，Ds为供试品预稀释率，Dr为标准品预稀释率，Es为供试品相当于标准品半效量的稀释率，Er为标准品半效量的稀释率。

图5 电泳法测定rhEGF 的相对分子质量

图6 电泳法测定rhEGF 的纯度

图7 高效液相色谱法测定rhEGF 的纯度

图8 rhEGF 标准品（A）与纯化样品（B）的四参数回归曲线

表1 rhEGF细胞活性MTT法检测结果统计

经计算，rhEGF 活性约为1.29×106IU/mL，比活性约为4.94×107IU/mg。本实验中使用的标准品生物活性为1×107IU/mg，制备获得的rhEGF 生物活性高于标准品。

3 讨论

EGF 的诸多生物学功能使其在创伤治疗和化妆品领域有着广泛的应用，随着研究的深入，人们发现它在抗肿瘤的临床应用方面也有广阔前景[5]，因此，获得大量有生物活性的hEGF 尤为必要，然而hEGF 的应用始终受到其产量问题的制约[6]。我们根据原核表达系统的喜好，对rhEGF 的基因序列进行了同义置换，实现了其在原核表达系统内的优势表达，从而能够大量获得rhEGF 的包涵体，经Ni 柱纯化并稀释复性后可得到具有较高活性的rhEGF，相对分子质量约6.5×103，生物活性可达4.94×107IU/mg。这使得大量生产高纯度、高活性的rhEGF 成为可能，为后期大规模生产奠定了基础。