张晶晶，肖红剑，龙琼，浦滔，李智华，寸韡

中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，云南昆明650118

过敏性疾病被世界卫生组织列为21 世纪重点防治的三大疾病之一，同时又被认定为当今世界性的重大卫生学问题。过敏性疾病临床症状包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等。流行病学调查显示，世界人口的5%～16%患有过敏性哮喘，过敏性疾病的发病率逐年上升，每年可导致18 万人死亡。但是，过敏性疾病作为一个复杂的疾病，迄今没有一种满意的治疗方案。研究表明，IgE 及其高亲和力受体α亚基（FcεRIα）在过敏反应中发挥至关重要的作用。IgE FcεRI 由胞外α、β及γ-γ链组成，其中α亚基结合IgE 引起嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放大量过敏介质，从而引起炎症[1-2]。随着树鼩基因组数据的解析，发现树鼩免疫系统与灵长类动物具有较高的同源性[3-4]。目前研究过敏反应的动物模型局限于啮齿类动物，对树鼩的相关研究较少。我们在本实验中制备了树鼩IgE FcεRIα单克隆抗体并进行了检测，为今后研究树鼩过敏反应动物模型提供检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级雌性BALB/c 小鼠（4～6 周龄）由中国医学科学院医学生物学研究所小动物中心提供；Sp2/0 细胞由本实验室保存；胎牛血清、DMEM 培养基、RPMI-1640 培养基、HAT 培养基、HT 培养基等均购于Gibco 公司；免疫原树鼩IgE FcεRIα蛋白由本实验室纯化制备；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG购于Abcam 公司；HRP 标记的羊抗兔IgG、驴抗兔IgG（Alexa fluor 594）购于Proteintech 公司。

1.2 免疫

用树鼩IgE FcεRIα背部皮下免疫雌性BALB/c 小鼠。第一次免疫剂量为50 μg/只，用PBS 缓冲液稀释蛋白至适量体积，加入等体积的弗氏完全佐剂，用10 mL 注射器推拉至油包水状态，将乳化好的抗原背部皮下多点免疫；2 周后进行二次免疫，免疫剂量为25 μg/只，将IgE FcεRIα与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫，第4周、第6 周采用相同方法进行免疫。每次免疫1周后取小鼠血清检测效价，以待测孔D450nm值（P）与阴性孔D450nm值（N）的比值≥2.1，效价达到1∶4000 后，取效价最高小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0 进行融合。

1.3 细胞融合

细胞融合前将RPMI-1640 培养基及PEG-1500 在37℃预热，取效价最高小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞按8∶1 的比例混合，1000 r/min 离心5 min，弃上清，将细胞吹散，37℃下缓慢加入PEG溶液，边加边晃动离心管，37℃水浴锅中静置1 min，加入RPMI-1640 培养基以终止PEG 作用，加入培养基速度逐渐加快，边加边晃动离心管；细胞融合终止后，1000 r/min 离心5 min，弃上清，加入HAT 培养基，轻轻吹打细胞至均匀，步骤参考文献[5-6]。

1.4 杂交瘤细胞的筛选

细胞融合7 d 后通过ELISA 法检测抗体，选择分泌抗体阳性孔，用HT 培养基扩大培养，用有限稀释法经过3 轮亚克隆筛选出持续分泌抗体的稳定细胞系并扩大培养后冻存；取杂交瘤细胞上清，采用Sigma 公司的抗体亚类试剂盒测定单抗亚型。

1.5 树鼩IgE FcεRIα单抗特性检测

1.5.1 Western 印迹检测单克隆抗体特异性 利用原核表达IgE FcεRIα的菌液及树鼩组织进行检测单克隆抗体的特异性，SDS-PAGE 后转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞培养液按1∶200 稀释后室温孵育1 h，PBST洗涤4次，每次10 min；二抗羊抗鼠1∶5000 稀释后室温孵育45 min，PBST 洗涤4 次，每次10 min；ELC 显色，曝光。

1.5.2 间接细胞免疫荧光检测真核细胞表达的IgE FcεRIα 将质粒pAAV-CMV-tFcεRIα（本室提供）转染293T 细胞，48 h 后吸出细胞上清，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗涤；1% BSA 室温封闭30 min，PBS 洗涤；孵育一抗，按1∶2000 室温孵育30 min，PBS 洗涤；孵育荧光二抗（驴抗兔IgG，Alexa fluor 594），按1∶2000 室温避光孵育30 min，PBS 洗涤；滴加DAPI 复染核并封片，荧光显微镜下观察。

1.5.3 免疫组化检测单克隆抗体生物学活性 将制备的石蜡切片（气管组织、肺组织）进行脱蜡、水化、0.01 mol/L 枸橼酸钠缓冲液抗原修复、3%H2O2-PBS 溶液灭活内源性酶、4% BSA 封闭、孵育一抗和二抗、DAB 显色、复染、脱水等步骤，检验单克隆抗体是否能检测组织中的IgE FcεRIα。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞筛选

细胞融合后，通过间接ELISA 法检测杂交瘤细胞上清抗IgE FcεRIα抗体效价，经3～4 次克隆化培养筛选出5 株可持续分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为HC020、HC021、HC022、HC023 和HC024。结果如图1。

2.2 杂交瘤细胞亚型鉴定

采用Sigma 公司的抗体亚类试剂盒测定单抗抗体亚型。按照操作说明包被、封闭，腹水按1∶500 稀释后作为一抗，100 μL/孔加入96 孔酶标板，37℃孵育1 h，PBST 洗涤3 次，将HRP 标记的羊抗鼠各抗体亚类的二抗按1∶500 稀释，按照抗鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 的顺序加入，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST 洗涤3 次，加入现配的显色液，100 μL/孔，室温显色10～20 min，每孔加入50 μL 终止液，酶标仪上读取D450nm值。5株单克隆抗体的亚型见表1。

2.3 单克隆抗体特异性及间接免疫荧光检测

图1 单克隆抗体效价检测

图2 单克隆抗体特异性检测

表1 5株单克隆抗体亚型分类

利用树鼩IgE FcεRIα原核表达IPTG 诱导前及诱导后的菌液检测5 株单克隆抗体的特异性。Western 印迹表明5 株单克隆抗体均能检测出IPTG 诱导后的菌液，检测条带大小与预期相同且特异性较强（图2）。质粒pAAV-CMV-tFcεRIα转染293T 细胞后，间接免疫荧光均能检测到真核细胞表达的树鼩IgE FcεRIα蛋白，且该蛋白表达于细胞膜上，证明5 株单克隆抗体均能用于间接免疫荧光检测（图3）。

2.4 免疫组化检测单克隆抗体生物学活性 免疫组化检测树鼩肺、气管组织石蜡切片中的IgE FcεRIα，以肥大细胞Chymase抗体作为阳性对照。结果表明，单克隆抗体HC020、HC022、HC024能够检测组织中的IgE FcεRIα（图4）。

3 讨论

IgE 与其受体的特异性结合是过敏性疾病发生的特异性途径[7]。目前，IgE 及FcεRI 复合体的结构已阐明。FcεRI 由α、β、γ亚基组成，其中α亚基包括胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区主要负责与IgE 结合，在过敏反应信号通路传导过程中至关重要[2]。研究发现，IgE-Fc∶FcεRI 复合物晶体结构表明抗体和受体形成1∶1 复合物的机理是受体结合抗体Fc 段二聚体的每一条链[8]。因此，过敏反应治疗不应局限于抗IgE 治疗，其结合受体也可作为治疗过敏性疾病的靶点之一。2003年在美国上市的Omalizumab 针对IgE 而进行抗IgE 治疗[9]；Jardieu 制备 的 抗IgE 抗体E25（结合位点即IgE 和FcεRIα正常作用位点）能起到缓解过敏性疾病的效果[10]。虽然越来越多的药物有治疗和缓解过敏性疾病的效果，但过敏反应的机制还未阐明，并且缺乏合适的动物模型。随着树鼩基因组的阐明，证实了树鼩与人类具有更近的亲缘关系，因此在多种疾病的模型研究中可发挥重要作用[4,11]，但迄今树鼩作为过敏反应动物模型的研究尚少。我们制备出鼠抗树鼩IgE FcεRIα的单克隆抗体，并通过间接细胞免疫荧光及免疫组化证明制备的单克隆抗体可用于研究树鼩过敏反应动物模型的检测工具，同时，该抗体今后也可用于筛选树鼩肥大细胞及嗜碱性粒细胞，为树鼩过敏反应疾病动物模型的建立奠定了基础。

图3 间接细胞免疫荧光检测单克隆抗体生物学活性

图4 免疫组化检测树鼩组织单克隆抗体生物学活性