许思佳　颜　斌　董京祥　武丹阳　李慧玉*

(1.东北林业大学林木遗产育种国家重点实验室，哈尔滨　150040； 2.东北林业大学，哈尔滨　150040)

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子是一类在生物界广泛存在的转录因子家族，其通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达[1]。1989年，从小鼠中首次鉴定出bHLH转录因子E12和E47以来，越来越多的bHLH转录因子在线虫、果蝇、小鼠和人类中得到了分离鉴定[2]。随着研究的不断深入，在植物中功能也陆续被揭示。目前，在拟南芥中有162个成员，在水稻中则有167个成员，并且都已被定位到了染色体上[3～4]。研究发现bHLH转录因子在植物的生长发育，花形成和种子的萌发，控制气孔细胞的分化及保卫细胞的形成，生物合成及信号转导等生长阶段都发挥重要的作用[5～12]。对于bHLH的研究多集中在草本植物中，木本植物研究较少。在柽柳中ThbHLH1诱导了抗逆性基因LEAs和HSPs的表达并通过提高土壤的渗透势来提高非生物胁迫的耐受能力[13]；低温条件下，苹果中MdbHLH3基因能调控花青素的积累和果实的颜色[14]；胡杨PebHLH35基因过表达后通过减少气孔的数量，降低气孔开度，降低蒸腾速率，减少耗水量，提高光合作用来增强耐旱性[15]。

BEE(Brassinolide Enhanced Expression)基因所编码的蛋白质是属于bHLH超家族的一员，是调控油菜素内酯(BR)信号转导的重要元件[16]。在研究BR应答下游基因BRI1复合体时发现了3个基因，它们编码亲缘关系相近的碱性/螺旋—环—螺旋(bHLH)蛋白，于是将这3个基因命名为BEE1，BEE2，BEE3。在拟南芥中发现3个BEE基因是BR信号途径中是早期应答受体，该基因间存在功能冗余，3个基因同时突变的拟南芥表现出植株矮小和开花延迟等现象。除此之外，还发现在拟南芥的幼苗中，bHLH类蛋白BEE和BIM能正调控光响应途径[17]。对BEE基因的功能研究仅限于此。

白桦(Betulaplatyphylla)为我国北方的主要用材树种，也是天然次生林的先锋树种，在天然林更替方面起到了重要作用。本研究以东北白桦(B.platyphylla)为试材，根据白桦基因组序列，克隆获得了BpBEE1基因的启动子，通过启动子组织部位表达、激素及胁迫处理分析其表达特性，为揭示BpBEE1基因的功能提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

BpBEE1基因启动子克隆材料取自东北林业大学林木遗传育种试验基地10年生已开花结实的白桦，拟南芥为哥伦比亚野生型。DNA提取剂盒和纯化试剂盒购于天根生物技术公司；ExTaq聚合酶、T4连接酶、BamHⅠ内切酶、SmaⅠ内切酶购于宝生物工程(大连)有限公司；农杆菌EHA105和pBI101载体均为本实验室保存。

1.2　实验方法

1.2.1白桦BpBEE1基因启动子的克隆

根据白桦基因组序列，在BpBEE1基因ATG的上游1 750 bp位置设计引物，在上、下游引物的5′端分别引入核酸内切酶酶切位点(BamHⅠ)和(SmaⅠ)构建pBI101-BpBEE1promoter-GUS植物表达载体，引物由上海生工公司合成，上、下游引物序列分别为：5′-CGGGATCCCCCATCATGCTTGCATTTGG-3′(BamHⅠ)；5′-ACGCGTCGACCCTGTGAAGCAGCATCATCC-3′(SmaⅠ)。以白桦植物基因组DNA为模板，PCR扩增带有酶切位点的BpBEE1基因的上游启动子片段，反应体系如下：10×KOD Buffer 2 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各为10 mmol·L-10.6 μL，KOD Plus Neo 0.3 μL，无菌水补足20 μL。PCR扩增程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行胶回收纯化，回收后用核酸测定仪测其浓度，送公司测序。

1.2.2白桦BpBEE1基因启动子序列分析

采用PLACE[18](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE[19](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)网站上预测启动子序列中所含有的顺式作用元件。

1.2.3pBI101-promBpBEE1启动子植物表达载体的构建

分别对BpBEE1启动子胶回收产物和植物表达载体pBI101质粒进行BamHⅠ和SmaⅠ双酶切。酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。使用OMEGA纯化试剂盒对得到的启动子片段和载体的酶切产物进行纯化，纯化后产物用T4DNA连接酶16℃过夜连接，连接反应完成后，通过热击法将连接产物转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中。PCR检测条带位置正确的阳性克隆送往上海英俊生物公司测序。保存经测序比对正确的重组质粒，通过电击法将构建好的植物表达载体转入农杆菌EHA105中，转化子经PCR验证后保存备用。

1.3　拟南芥的遗传转化

采用农杆菌介导的浸花法进行遗传转化[20]。获得的T0代种子在含有50 μg·μL-1卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选。提取生长3周的抗性植株基因组DNA,以非转基因拟南芥(NT)为阴性对照，同时设阴性水对照，对转基因植株进行PCR扩增，以检测目的基因是否成功导入到植物体内。

1.4　转基因拟南芥的组织化学染色分析

(1)将pBI101-promBpBEE1启动子转基因拟南芥T3代纯合系的种子消毒后，播种于1/2 MS培养基上，分别在播种后1、2、5和8周取材，放置于5 mL试管中进行GUS染色(GUS染液：50 mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)，10 mmol·L-1EDTA·2Na溶液，0.1%Triton X-100，0.5 mmol·L-1亚铁氰化钾，0.5 mmol·L-1铁氰化钾，1 mg·L-1X-Gluc)，37℃条件下暗培养过夜，将染色后的拟南芥材料置于脱色液(脱色液∶无水乙醇与冰乙酸以3∶1比例混合)中脱色6～8 h，期间需更换脱色液。待脱色完全后，观察GUS染色情况并照相保存。

(2)将pBI101-promBpBEE1启动子转基因拟南芥T3代纯合系的种子消毒后，播种于1/2 MS培养基上，待播种2周长出2片真叶时，分别进行激素和胁迫处理，处理条件如下：1 mmol·L-1SA、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1IAA、100 μmol·L-1GA3、1 μmol·L-1BZR、1 μmol·L-1BL、20% PEG600、200 μmol·L-1NaCl。分别吸取100 μL的激素、NaCl、PEG600在培养基表面，用涂布棒涂均匀，同时设置涂有100 μL无菌水的培养基作为对照，随后将拟南芥幼苗置于培养基表面，培养24 h后进行GUS染色，观察染色情况并照相保存。

2　结果与分析

2.1　pBI101-promBpBEE1的克隆

以多年生白桦的叶片DNA为模板，根据白桦基因组获得的BpBEE1上游启动子序列设计特异引物，进行PCR扩增，扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结果显示在1 750 bp处获得特异条带(图1)，并与目标条带大小一致，并通过测序进一步确认为目的片段。

图1　BpBEE1启动子的克隆　1. DL2000 Marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)；2. BpBEE1启动子Fig.1　BpBEE1 promoter clone　1. DL2000 Marker(2 000,1 000,750,500,250,100 bp)；2. BpBEE1 promoter

顺式作用元件名Cis-actingelementname序列Sequence拷贝Copy功能FunctionAuxRR-coreGGTCCAT1参与植物生长素应答Cis-actingregulatoryelementinvolvedinauxin5UTR、Py-richstretchTTTCTTCTCT1增强转录水平ConferringhightranscriptionlevelsABREACGTGGC2顺式元件参与脱落酸应答Cis-actingelementinvolvedintheabscisicacidresponsivenessTATA-boxTAATA,TATA,TTTTA3核心启动子在转录起始Corepromoterelementaround-30oftranscriptionstartTATC-boxTATCCCA1参与赤霉素反应Cis-actingelementinvolvedingibberellin-responsivenessACEAAAACGTTTA1参与光反应Cis-actingelementinvolvedinlightresponsivenessAT-richsequenceTAAAATACT1激活诱导子Elementformaximalelicitor-mediatedactivationHSEAAAAAATTTC1参与高温胁迫Cis-actingelementinvolvedinheatstressresponsivenessTCA-elementCCATCTTTTT3参与水杨酸反应Cis-actingelementinvolvedinsalicylicacidresponsivenessCAAT-boxCAAT,CAAAT,CCAAT3启动子与增强子中的通用元件Commoncis-actingelementinpromoterandenhancerregionsTC-richrepeatsGTTTTCTTAC1参与防御和应急反应Cis-actingelementinvolvedindefenseandstressresponsivenesscircadianCAAAGATATC1参与昼夜节律的调控Cis-actingregulatoryelementinvolvedincircadiancontrolGT1CONSENSUSGRWAAW(R=A/G;W=A/T)5参与光反应,与水杨酸反应相关ParticipateinlightreactionandsalicylicacidreactionPYRIMIDINEBOXOSRAMY1ACCTTTT3参与赤霉素Cis-actingelementinvolvedingibberellin-responsivenessCGTCA-motifCGTCA1参与茉莉酸甲酯应答Cis-actingregulatoryelementinvolvedintheMeJA-responsivenessGT1GMSCAM4GAAAAA5抗病原体和盐胁迫Anti-pathogenandsaltstressWRKY71OSTGAC4赤霉素的转录抑制因子Gibberellintranscriptionalrepressor

2.2　BpBEE1启动子序列元件分析

利用PLACE和Plant CARE数据库对BpBEE1基因启动子进行元件预测分析(图2和表1)，发现该序列上除了含有启动子的基本转录元件TATA-box和CAAT-box外，还含有多个与激素相关的元件，其中与水杨酸应答有关的元件有GT1CONSENSUST和TCA-element，位点分别有5个和3个；赤霉素应答相关的元件有WRKY71OS、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A和TATC-box、位点分别有4个、3个和1个；2个脱落酸应答元件ABRE；1个植物生长素应答有关的元件AuxRR-core；1个茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif，1个高温胁迫元件HSE，1个抗病原体和盐胁迫的元件GT1GMSCAM，多个光响应元件等。由此可以推测该基因可能参与到了白桦的激素应答，高温胁迫响应，光响应等生物学过程中。

2.3　pBI101-promBpBEE1-GUS载体构建

以测序确定正确的PCR产物为模板进行PCR扩增，通过酶切、连接构建载体pBI101-promBpBEE1-GUS，分别以pro-BpBEE1-F和pro-BpBEE1-R为引物进行菌液PCR检测，结果显示在1 750 bp处获得特异条带，并与目标条带大小一致(图3A)。

为了确认pBI101-promBpBEE1载体序列是否正确，对重组的pBI101的插入片段进行测序，经序列比对发现测序结果与BpBEE1基因启动子的DNA序列完全相同，表明此植物表达载体已经构建成功。将构建成功的pBI101-promBpBEE1载体质粒转化入根癌农杆菌EHAl05内，PCR检测无误后(图3B)，向菌液中加入等体积的50%无菌甘油并保存于-80℃冰箱，用于后续的拟南芥转化。

图2　BpBEE1启动子作用元件示意图Fig.2　BpBEE1 promoter action element diagram

图3　构建BpBEE1启动子载体过程PCR检测　A.重组载体质粒的检测：1. DL2000 Maker；2.水对照； 3～4.重组载体质粒　B.工程菌PCR检测：1. DL2000 Maker；2.水对照；3～4.农杆菌样品Fig.3　Construction of BpBEE1 promoter vector for PCR detection　A. Detection of recombinant vector: 1. DL2000 Maker; 2. Water control; 3-4. Recombinant vector plasmid　B. Detection of engineering bacteria PCR: 1. DL2000 Maker; 2. Water control; 3-4. Agrobacterium samples

2.4　转pBI101-promBpBEE1启动子拟南芥的分子检测

以转基因拟南芥的叶片为模板提取植物总DNA，进行PCR扩增，扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结果显示在1 750 bp处获得特异条带，并与目标条带大小一致(图4)，说明BpBEE1启动子已转入拟南芥中。

图4　转BpBEE1启动子拟南芥PCR检测　1. DL2000 Marker；2.水对照；3.WT；4.试样Fig.4　BpBEE1 gene promoter transgenic Arabidopsis PCR detection　1. DL2000 Marker; 2. Water control; 3. WT; 4. Sample

2.5　转pBI101-promBpBEE1启动子拟南芥的组织化学染色分析

将不同生长时期的拟南芥组织分别GUS染色，从图中可以看到，在拟南芥幼苗生长至2片子叶(1周)时，转基因幼苗没有被GUS染成蓝色(图5A)；当拟南芥幼苗出现2片真叶(2周)时，真叶的叶柄和叶脉位置被染成蓝色，其他部位没有着色(图5B)；当拟南芥生长至开花(5周)时，叶脉、茎、主根分别呈现蓝色和浅蓝色(图5:C～F)，花未着色(图5E)；当拟南芥生长结果夹(8周)时，果夹和茎没有被明显染成蓝色(图5:G～H)，而叶脉和主根的部分被GUS染成蓝色(图5:I～J)。

2.6　不同激素对于转基因拟南芥GUS染色的影响

我们对生长2周的转基因拟南芥分别进行激素及胁迫处理发现，转基因拟南芥在不同激素处理之后GUS的活性有一定的变化。MeJA、SA、BL和ABA处理后GUS活性增强，其中MeJA、SA、BL处理后的GUS染色最深，ABA次之；IAA、BZR、GA3、NaCl和PEG处理后的GUS酶活性无明显变化(图6)。

3　讨论

植物bHLH转录因子广泛地参与了植物的生长发育过程。拟南芥bHLH家族复合物LHW(LONESOME HIGHWAY)和TMO5(TARGET OF MONOPTEROS5)能够与植物激素的信号分子相结合从而调控维管的早期发育[21]；转AtbHLH129基因的过表达拟南芥株系呈现根伸长的现象[22]；拟南芥AtGL2基因能结合bHLH家族中与根毛发育相关的基因RHD6，RSL1，RSL2，LRL1及LRL2的上游区域，从而抑制这些基因的表达[23]。通过对转promoter-BEE1拟南芥进行组织部位染色发现，在叶脉、根部以及茎部GUS活性增强，说明白桦BpBEE1基因可能参与这些组织部位的发育。

通过对BpBEE1启动子顺式作用元件分析预测得知，BpBEE1启动子序列除了含有启动子的核心元件外，还含有一些激素响应元件。JA是植物生长发育过程中必不可少的植物激素，并能诱导次生代谢产物的生物合成而bHLH类等转录因子能够影响JA的合成从而调控次生代谢产物的积累。研究发现bHLH类基因JAMYC2、JAMYC10能够对茉莉酸信号做出响应，在植物茉莉酸信号转导途径中起到重要的调控作用；苹果中的MdMYC2基因与拟南芥的MYC2基因具有很高的同源性，MdMYC2结合AtJAZ3基因(JA信号转导的抑制蛋白)的G-Box来调节对MeJA的敏感程度[24]；BpBEE1启动子序列含有JA应答元件CGTCA-motif，我们对转BpBEE1启动子的拟南芥进行MeJA处理后发现，GUS的活性明显提高，说明BpBEE1参与JA应答过程。在拟南芥中AtbHLH129过表达后会通过抑制ABA合成相关基因ABI1，SnRK2.2，SnRK2.3及SnRK2.6的表达来负调控ABA的响应[22]；在苦荞中FtbHLH3基因能提高转基因拟南芥的耐旱性，并发现在胁迫株系中ABA生物合成基因AtNCED的表达明显增强，BpBEE1启动子序列含有2个ABA应答元件ABRE，并且ABA处理后，转BpBEE1启动子的拟南芥GUS的活性提高[25]。前人研究发现，BEE是BR的早期应答基因[17]，而BL是BR的主要成分，本实验也证实经BL处理后转基因拟南芥的GUS活性明显增强。因此，BEE基因可能通过激素信号影响植物的生长发育。除此之外，本文将进一步对该基因的功能进行深入研究，为揭示白桦BpBEE1基因的功能提供理论基础。

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