李杨洋 焦浈

（郑州大学离子束生物工程省重点实验室，郑州 450052）

冬小麦以及半冬性小麦多种植于我国华北及华中地区，低温驯化是小麦顺利进入越冬期的关键。据中国气象局统计，2016年11月中旬至12月中旬，河南省平均高温11℃，平均低温2℃，最低温度达-5℃，而2015年11月中旬至12月中旬，河南省省平均高温7℃，平均低温1℃，最低温度-7℃。2015年-2016年冬季北方冬麦区大部分平均气温接近常年同期或偏高1-2℃，但气温起伏较大，先后遭受4次强寒潮等极端天气过程袭击，冬小麦入冬早，冬前生长不足，个体偏弱［1］。小麦在经过极端天气袭击后，提前入冬，引发初冬冻害，不利于小麦后期生长发育。因此，增强小麦低温胁迫的耐受能力具有重要意义。

高等植物体内生理生化水平可有效反映植物受冷冻害程度，在此过程中，一些抗氧化酶如超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）能有效清除细胞内过多的自由基和活性氧，达到抗寒或缓解伤害的效果［2］。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂膜过氧化作用产物之一，对机体有毒害作用，MDA大量积累会造成膜透性增大，电解质外渗，使细胞膜受到损伤［3］。植物细胞中游离脯氨酸有极强的亲水性，能够防止细胞水分流失、降低冰点，稳定细胞原生质体和代谢活动［4］。可溶性蛋白作为植物细胞中酶的重要组成成分，参与多种细胞生命代谢活动，是植物细胞内重要的渗透调节物质，也是植物冷冻害指标之一［3］。

CBF（C-repeat binding factors）是一类冷调控转录因子，隶属于AP2/EREBP转录因子家族，对调节植物低温耐受性有重要作用。已有研究表明，CBF冷调控转录因子通过ICE-CBF-COR通路对植物低温耐受起到了重要作用［5］。当植物体受到低温胁迫后，CBF转录激活因子（Inducer of CBF expression ICE）诱导CBF表达［6］，而后CBF与下游冷调控基因（Cold-regulated gene COR） 中 的 CRT（C-repeat element CRT/DRE）元件结合，诱导COR下游基因的表达［7］，从而提高植物低温耐受能力。CRT/DRE原件含有CCGAC核心序列（Low temperatureresponsive element，LTRE），该序列普遍存在于冷诱导和脱水诱导基因的启动子中，为这类基因的诱导表达所必需［8］。因此，CBF基因家族的表达是植物在分子水平抗寒机制的关键途径之一［9］。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是一种茉莉酸（Jasmonic acid，JA）类似物，广泛存在于高等植物体内，是天然合成的新型生长调节物质［10］。经研究，MeJA在植物生长发育中起着重要的作用，可抑制花粉粒萌发、促进叶片衰老、果实成熟、诱导块茎形成、诱导卷须卷曲以及促进叶片气孔关闭［11-12］。内源茉莉酸类物质在植物受到伤害胁迫时，会与其他内源信号分子如水杨酸、脱落酸、乙烯等诱导相关抗逆基因的表达。因此，外源MeJA的喷施有望成为提高小麦抗寒能力的新途径［13］。

本研究以华北及华中地区种植较广的矮抗58小麦品种为材料，分别经过双蒸水与外源MeJA喷施小麦幼苗后，测定小麦在冷驯化条件下的成活率、抗氧化酶活性、MDA含量、脯氨酸及可溶性蛋白含量，并结合实时荧光定量PCR技术分析抗寒应答因子TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19在冷驯化条件下的表达量，以探究外源MeJA对小麦对低温胁迫抵抗能力的调控效应，从而为提高小麦在冷驯化条件下的抗寒能力提供一种可行性技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦品种为矮抗58，由郑州大学离子束实验室提供。MeJA饱和溶液购于上海瑞永生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源MeJA喷施和冷驯化处理 实验设两组小麦幼苗：双蒸水低温处理（对照组）和外源MeJA喷施低温处理（实验组），每组50株小麦幼苗，每组设3组重复，小麦种子经0.1%HgCl2表面消毒15 min，蒸馏水清洗3次，浸种24 h后播种于蛭石、细沙的培养钵中，每钵10株，每5 d浇灌一次培养液（Hoagland 全营养液），于4 000 lx，25℃光照培养箱中培养至三叶期后，使用双蒸水对对照组小麦幼苗叶片进行喷施，使用浓度为100 μmol/L的MeJA对实验组小麦幼苗叶片进行喷施后将幼苗置于4℃低温条件下处理7 d，第7天后分别取两组小麦叶片4 g经液氮处理后低温保存以备用［14］。

1.2.2 生理生化指标测定 小麦幼苗低温伤害部位主要为叶片，多发萎蔫干枯失绿，随后发黄变干死亡［15］。7 d低温处理后，统计成活率；SOD、POD、CAT、MDA、脯氨酸和可溶性蛋白的测定参考高俊凤、张志良等方法［16-17］，使用Thermo ScientificTMVarioskanTMLUX 多功能微孔板读数仪测定吸光度。1.2.3 TaCBFs抗寒应答转录因子qRT-PCR分析 取两组小麦幼嫩叶片，TRizol试剂快速提取法提取 RNA［18］，反转录体系为 120 μL，20 μL 模板，使用oligo-dT引物法将RNA转录为cDNA［19］。根据GenBank数据库提供的TaCBFⅣd-B4（EF028781）、TaCBF Ⅲ d-B19（EF028767）、TaCBF Ⅲ c-D3（EF028760）和 TaCBFⅢ d-D19（EF028768）基因序列信息［9］，利用Primer Premier 5.0设计引物序列，以GDPDH为参照基因，如表1。使用SYBR Green作为荧光显示剂进行荧光实时定量PCR，反应总体系为15 μL，正反向引物各0.3 μL，cDNA模板 1 μL，SYBR Green 7.5 μL，双蒸水 5.9 μL，反应条件：95℃预变性2 min，94℃变5 s，62℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环，65℃15 s生成溶解曲线，40℃冷却30 s。每个样品设3次重复。

1.2.4 数据处理分析 使用Excel 2007软件对实验数据进行分析作图，使用IBM SPSS statistics13.0软件对数据进行单因素方差分析及显著性检验。基因表达量分析使用相对定量分析中的2-△△Ct法分析［20］，计算所得全部数据将处理组矫正为1，以1作为相对表达量，实验组数据为其相对倍数。

表1 参照基因和TaCBFs抗寒应答因子引物序列

2 结果

2.1 生理生化指标

2.1.1 成活率 低温处理后对照组3组小麦幼苗成活率平均为84%；而经过外源MeJA喷施的低温处理的3组小麦幼苗成活率平均数达到91%。除小麦叶片干枯发黄冻死外，冷处理后小麦叶尖有发黄干枯现象，以低温处理组小麦发生居多。结果（图1）表明，外源MeJA喷施可以减轻小麦受低温伤害，从而提高成活率，减少幼苗损失。

图1 矮抗58小麦幼苗成活率

2.1.2 SOD活性、CAT活性、POD活性以及MDA含量 如图2所示，经过外源MeJA喷施进行低温处理后的小麦幼苗中SOD、CAT和POD三种抗氧化酶活性较对照组分别提高了34%、50%和14%，MDA含量降低了5%。结果表明，低温处理后，外源MeJA的喷施可以有效提高小麦幼苗中SOD、CAT、POD抗氧化酶活性，同时降低MDA含量，通过提高抗氧化酶活性以降低小麦幼苗细胞损伤，提高小麦低温耐受能力。

2.1.3 可溶性蛋白和游离脯氨酸含量 如图3所示，外源MeJA喷施低温冷处理后小麦幼苗中可溶性蛋白和游离脯氨酸含量较对照组分别提高了30%和14%。结果表明，在低温处理后，外源MeJA的喷施可以有效提高小麦幼苗中的可溶性蛋白含量和游离脯氨酸含量，以此提升小麦抗低温能力。

2.2 抗寒应答转录因子表达分析

如图4所示，经过外源MeJA喷施低温处理实验组小麦幼苗中TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19表达量较对照组有明显的提高，其中CBFⅣd-B4荧光表达量在4个基因中最高，CBFⅣd-B4基因表达量为对照组34.78倍，TaCBFⅢc-D3基因表达量为对照组的24.2倍，CBFⅢ3d-B19基因表达量为对照组的21倍，CBFⅢd-D19基因表达量为对照组的19.93倍。4个基因表达量结果皆表现为上调表达。结果表明，外源MeJA的喷施可以有效促进TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19的表达以应对冷环境胁迫。

图2 矮抗58小麦幼苗中SOD（A）、CAT（B）、POD（C）活性及MDA（D）含量

图3 矮抗58小麦幼苗中可溶性蛋白（A）及游离脯氨酸（B）含量

3 讨论

小麦在进入越冬期之前会有较长的低温期，在经受低温胁迫时，小麦中抗寒应答转录因子CBF基因家族参与低温胁迫抗逆代谢，CBF转录因子在干旱、高盐及低温胁迫信号传递中能够起到重要作用［21-22］。近几年国内外对小麦CBF家族基因的研究主要为转基因以及抗寒诱导机制方面。CBF转录因子可激活具有DRE顺式作用原件的多个与干旱、高温及低温耐性有关功能基因的表达，从而使得小麦的抗逆性提高［23］。本实验结果显示，外源茉莉酸甲酯喷施后，小麦幼苗抗寒应答转录因子TaCBFⅣ d-B4、TaCBFⅢ 3d-B19、TaCBFⅢ c-D3和TaCBFⅢd-D19荧光表达量较低温处理组明显升高，表明在100 μmol/L浓度下外源MeJA可以诱导以上基因的表达。进一步说明，通过外源茉莉酸甲酯诱导抗寒基因的表达，可以促进小麦细胞内部生理生化机制的抗寒反应，生成小麦抗逆相关酶及抗逆物质，从而提高小麦抗低温能力。

当小麦受到低温胁迫时，会产生大量活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS），会对脂膜、蛋白以及遗传物质造成伤害，MDA是细胞脂膜过氧化后的产物，而SOD、CAT及POD等抗氧化酶可以有效清除ROS，降低MDA含量。可溶性蛋白和游离脯氨酸可以调节胞内渗透压，降低小麦细胞基质冰点，以此保护细胞免受低温处理的伤害［24-25］。本实验结果显示，外源MeJA喷施的处理组小麦幼苗中SOD、CAT、POD抗氧化酶含量较对照组明显提高，同时降低了脂膜过氧化产物MDA含量，可溶性蛋白和脯氨酸含量也明显升高，有效提高了小麦幼苗的抗寒耐受能力，这与齐付国等［14］和刘彧等［26］研究结果相似。已有研究表明，外源MeJA可促进细胞衰老［27］。实验结果显示，经过外源MeJA喷施后低温处理的小麦幼苗存活率显著升高，降低了小麦死亡率，保证了后期小麦的产量。此外，外源MeJA除提高小麦抗寒能力以及其他环境胁迫抵抗能力之外，还能有效提高小麦抗病性，如白粉病、赤霉病和锈病［28-29］。

有研究表明，在低温环境下，外源茉莉酸甲酯的喷施可以有效提高小麦内源茉莉酸的含量［30］，而内源茉莉酸可有效应对小麦受到的伤害以及病原体入侵，当小麦受到低温驯化后内源茉莉酸含量下降，直至第7天开始回升［31］。生理生化水平及分子水平皆显示，外源茉莉酸甲酯的喷施可有效提高小麦幼苗的耐寒能力。除此之外，有研究表明，外源水杨酸、赤霉素和脱落酸与茉莉酸甲酯有相似的作用［32-33］。目前，对于外源茉莉酸甲酯在小麦育种生产中的应用还不成熟，原因可能是茉莉酸类物质在植物体中的作用和作用机制还不够清楚。另外，茉莉酸类物质在市场售价较高，针对大面积作物的使用不够经济。因此，外源茉莉酸甲酯对冷处理小麦的作用和作用机制还需进一步地在分子和蛋白水平展开研究。

图4 矮抗58小麦幼苗中CBF IV d-B4（A）、CBF III 3d-B19（B）、TaCBF III c-D3（C）和CBF III d-D19（D）荧光表达量

4 结论

4℃低温处理7 d后，外源MeJA的喷施能显著提高小麦抗氧化酶活性及可溶性蛋白和脯氨酸含量、降低MDA含量，促进抗寒应答转录因子TaCBFⅣ d-B4、TaCBFⅢ 3d-B19、TaCBFⅢ c-D3、TaCBFⅢd-D19的表达，提高矮抗58小麦幼苗的低温耐受性。综上，通过对小麦幼苗叶片喷施茉莉酸甲酯能够有效提高小麦幼苗的低温耐受能力。

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