李瀚，顾磊#，李彤，张利红

鄂东医疗集团市中医医院（市传染病医院）1病理科，2肿瘤外科，3检验科，湖北黄石4350000

SIX1基因可特异性调控细胞增殖、分化和凋亡，参与胚胎细胞发育和器官分化，在肿瘤的发生、发展及转归中具有重要价值[1‐2]。研究发现SIX1基因在乳腺癌、宫颈癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中表达异常，在其病情及预后评估中具有重要价值，可能较传统的肿瘤标志物具有更高的准确度和特异度[3‐4]。本研究检测胃癌患者及慢性胃炎患者SⅠX1蛋白表达情况，研究其在胃癌病情评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2010年1月至2017年1月鄂东医疗集团市中医医院诊治的60例胃癌患者的病历资料为胃癌组，均符合以下标准：①经胃镜活检病理组织学检查、增强CT检查和（或）手术切除标本病理组织学检查确诊为胃癌；②首次手术治疗，非二次手术，既往未行手术、化疗或放疗治疗；③无其他包括肿瘤等疾病，无严重心、脑、肺疾病；④无手术禁忌证。另选择同期行胃镜活检病理组织学检查结果为慢性胃炎的30例患者的病历资料为对照组。两组患者性别、年龄、吸烟史、酗酒史和体重指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表1。

1.2 细胞与试剂

正常人胃黏膜细胞系（GES‐1）和胃癌细胞系（AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ）购自美国ATCC公司。兔抗人SⅠX1抗体购自美国Sigma公司，SP免疫组织化学试剂盒购自碧云天生物科技公司。幽门螺杆菌检测采用14C呼气试验检测。肿瘤最大径采用刻度尺直接测量手术切除标本原发灶。

表1 两组患者的一般资料

1.3 胃癌组患者SIX 1蛋白表达检测

胃癌组胃癌患者取胃癌组织和癌旁正常组织（距离肿瘤组织3 cm），对照组慢性胃炎患者取胃镜活检组织，采用SP法检测SⅠX1蛋白表达，标本加入兔抗人SⅠX1抗体一抗后37℃孵育2 h，后加入酶标二抗室温下孵育30 min，二氨基联苯胺（di‐aminobenzidine，DAB）显色剂显色15 min。SⅠX1蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞质和核仁，根据阳性细胞数的比例将染色结果分为3级：阴性为阳性细胞数占0～10%，阳性为阳性细胞数占11%～50%，强阳性为阳性细胞数占50%以上，阳性和强阳性被定义为蛋白表达阳性。

1.4 胃癌细胞系SIX 1蛋白表达检测

采用Western blot法检测正常人胃黏膜细胞系GES‐1和胃癌细胞系AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ的SⅠX1蛋白表达，选择β‐actin为内参照。检测方法如下：采用 Trizol提取 GES‐1、AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ胃癌细胞系蛋白质，加入兔抗人SⅠX1抗体，显色后，计算SⅠX1蛋白与内参β‐actin表达百分比。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理与统计学分析。计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK‐q检验，两独立样本组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组与对照组SIX 1蛋白表达的比较

胃癌组胃癌组织SⅠX1蛋白表达阳性41例，阳性表达率为68.3%；癌旁正常组织SⅠX1蛋白表达阳性为1例，阳性表达率为1.7%；对照组慢性胃炎组织SⅠX1蛋白表达阳性为1例，阳性表达率为3.3%；胃癌组胃癌组织SⅠX1蛋白表达阳性率高于癌旁组织和对照组慢性胃炎组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 胃癌组织SIX 1蛋白表达与临床病理特征的关系

不同性别、年龄、病变位置、病理类型和是否患幽门螺杆菌感染的胃癌组织SⅠX1蛋白阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；中+低分化、肿瘤最大径≥5 cm、淋巴结转移为 N2～3、有远处转移及病理分期为Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌组织SⅠX1蛋白阳性表达高于高分化、肿瘤最大径＜5 cm、淋巴结转移为N0～1、无远处转移及病理分期为Ⅰ+Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 胃癌组织SⅠX 1蛋白表达与临床特征的关系

2.3 胃癌细胞系SIX 1蛋白表达情况

胃癌细胞系 AGS、SGC‐7901和 KATO‐Ⅲ中SⅠX1蛋白表达均高于正常人胃黏膜细胞系GES‐1，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

3 讨论

胃癌的发病机制与多种因素有关，其中基因表达异常是最重要的发病机制，包括基因突变、单核苷酸多态性及表观遗传学等众多机制，与胃癌基因表达密切相关。SIX1基因属于转录调控因子，是E2F1的转录靶基因，在G1～S期转录激活，S期转录水平增加。SⅠX1通过激活靶基因如Cyclin A1、Cyclin D1等，启动靶基因转录，抑制与DNA结合的能力，最后在有丝分裂后期经蛋白水解降解[5‐6]，而SⅠX1的过表达则削弱了这一作用，加速细胞周期进程，造成细胞增殖，导致肿瘤的发生。此外，SⅠX1作为磷酸化蛋白，可被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化失活，从而调控细胞周期G1～M期的转变，尤其对DNA损伤的反应[7‐8]。目前的研究发现，SⅠX1蛋白表达在多种恶性肿瘤中显著上升，可能与病情及预后密切相关。王彤等[9]采用免疫组织化学SP法检测宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变组织及正常宫颈组织中SⅠX1蛋白的表达，发现宫颈癌组织SⅠX1蛋白阳性表达率高于宫颈上皮内瘤变组织及正常宫颈组织，认为SⅠX1与宫颈癌的发生发展密切相关，可能成为预测宫颈癌侵袭与转移的分子标志物。魏巧等[10]发现食管鳞癌患者SⅠX1蛋白在癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，进一步发现SⅠX1蛋白表达与肿瘤大小、肿瘤浸润深度及生存状态有关，认为SⅠX1蛋白高表达是食管鳞癌患者预后不良的因素，可作为临床预测食管鳞癌患者预后的一个重要指标。本研究中，胃癌患者癌组织中SⅠX1蛋白阳性表达率高于癌旁组织和慢性胃炎组织，胃癌细胞系AGS、SGC‐7901和KA‐TO‐Ⅲ中SⅠX1蛋白阳性表达均高于正常人胃黏膜细胞GES‐1（P＜0.05），这些证据证实SⅠX1蛋白表达异常与胃癌的发病机制有关。

图1 正常人胃黏膜细胞系GES‐ 1和胃癌细胞系AGS、SGC‐7901和KATO‐Ⅲ中SⅠX 1蛋白表达情况

传统的胃癌病情评估指标包括分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和病理分期，这些指标与病情及预后密切相关，可客观科学地反映胃癌患者的病情及预后，但这些传统指标多通过手术切除标本病理组织学检查获得，对于无法获取标本患者则不适用而限制其临床应用。本研究发现不同性别、年龄、病变位置、病理类型和是否患幽门螺杆菌感染的胃癌组织SⅠX1蛋白阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和病理分期患者胃癌组织SⅠX1蛋白阳性表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中+低分化、肿瘤最大径≥5 cm、淋巴结转移为N2～3、有远处转移及病理分期为Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌组织SⅠX1蛋白阳性表达高于高分化、肿瘤最大径＜5 cm、淋巴结转移为N0～1、无远处转移及病理分期为Ⅰ+Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.05），这些证据表明SⅠX1蛋白表达与胃癌的病情严重程度有关，可能SⅠX1蛋白阳性表达越高，胃癌病情越严重。SIX1基因可用于预测胃癌的病情，随着检测技术的发展，可能通过术前检测外周血或胃镜活检组织SⅠX1蛋白表达即可提供客观科学证据，较传统的评估指标可能具有更高的准确度及特异度，临床应用价值更高。值得注意的是，本研究对胃癌患者预后无相关研究，相信随着研究不断深入，SⅠX1蛋白表达的检测可能在胃癌预后评估中具有一定价值。

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