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羊传染性脓疱(Contagious ecthyma，CE)俗称羊口疮(Orf)，是由痘病毒科(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)成员羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)引起的一种高度嗜上皮性人兽共患病[1]。主要感染羔羊和幼羊，以口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱、痂皮为主要特征。ORFV 也能感染人[2-3]，是目前广泛流行于我国，且危害较严重的人兽共患痘病毒病。由于ORFV结构复杂、编码蛋白种类繁多，限制了人们对ORFV入侵相关机制的研究。

痘苗病毒(VACV)是痘病毒研究的模式病毒， VACV 的L1R蛋白含有250AA，N端包含有2个豆蔻酰化位点(GlyxxxSer/Thr)，而在ORFV基因组上ORF047命名为L1R，其编码的蛋白含有245AA,含有3个豆蔻酰化位点。全长与VACV基因组中的L1R在核苷酸水平上相似性为56.9%，氨基酸水平的同源性为59.8%，在N端的前20个AA中的二者的同源性达70%，而且存在相似的结构。我们推测ORFV ORF047基因编码的蛋白可能是VACV L1R蛋白的同系物。因此，我们克隆了ORF047基因，并构建到真核表达载体上，转染细胞，了解其表达和定位情况，为今后后续筛选与其相互作用的蛋白及该基因在在入侵宿主细胞过程中的作用研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1细胞株与病毒株HEK-293T细胞、Vero-E6细胞和ORFV/QH02/2010分离株均由本实验室保存。

1.2载体与试剂pEGFP-N1、pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito和pHcRed1-ER等载体均购自clontech公司；DNA Marker、Primer STARTM GXL DNA聚合酶、dNTPs及病毒DNA快速提取试剂盒等相关试剂，均购自宝生物工程 (大连) 有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒均购自天根生化科技有限公司；青霉素、链霉素、氨苄霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)等抗生素均购自北京索莱宝科技有限公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶、预染蛋白Marker、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、无血清OPTI-MEM培养基，脂质体3000(LipofectamineTM 3000)转染试剂等均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；EGFP抗体购自Santa cruz生物技术公司；PVDF膜购自Millipore公司。

1.3引物设计与合成根据在 GenBank 中OV-SA00毒株(NC-005336.1)ORF047基因序列，利用Primer 5.0生物信息学软件设计2对引物。克隆引物：ORF 047 F：5′-CGT GAACCA GAC CGT CGT C-3′， ORF 047 R：5′-CCAGTGCACCAC GGG CTT C-3′，用于克隆ORFV ORF047基因，预计扩增片段为735 bp；表达引物：pEGFP-ORF047 F (HindIII)：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGGGGGCCGCCG-3′，pEGFP-ORF047R (BamH I) 5′-CCGGATCCACGGACGGCGGAAATTC-3′，上述引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.4ORFV ORF 047基因的克隆按照病毒基因组DNA试剂盒说明书提取ORFV/QH02/2010株基因组DNA，并以此为模板， PCR扩增ORF047基因。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。 4 ℃终止反应后，用1.0 %琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，并用 DNA 胶回收试剂盒纯化PCR产物， 在4 ℃与pGEM-Teasy载体链接过夜，转化DH5α感受态细胞，经EcoR I酶切鉴定为阳性的克隆，送上海生物公司测序，测序正确的重组质粒命名为pGEM-ORF 047。

1.5pEGFP-ORF047重组真核表达质粒的构建利用合成的表达引物，以pGEM-ORF 047质粒为模板，PCR扩增目的片段，利用HindIII和BamH I限制性内切酶双酶切 PCR产物和pEGFP-N1质粒，分别回收、纯化目的基因片段和载体片段，再利用T4 DNA连接酶，将 ORF047基因定向插入pEGFP-N1载体，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种于含KanLB培养基，37 ℃过夜摇菌，提取质粒，经HindIII和BamH I进行酶切鉴定后，送上海生工生物工程有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pEGFP-ORF047。

1.6重组质粒pEGFP-ORF047转染293T细胞用QIAGENE 公司的QIAprep spin Mininprepkit 质粒提取试剂盒提取重组质粒, 并用紫外分光光度计测其浓度和纯度。按照LipofectamineTM3000说明书，转染至293T 细胞，同时设空白、不含插入片段的空载体pEGFP-N1作对照，转染 24 h后在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。

1.7SDS-PAGE电泳检测和Western-blot分析ORFV ORF047基因的表达转染293T细胞48 h后收集细胞，用预冷的细胞裂解液裂解细胞，14 000 r/min离心 10 min，收集沉淀，经SDS-PAGE电泳检测后转印到PVDF膜上，进行Western bloting检测，分析蛋白的表达情况，具体操作参见文献[4]。用PBST洗涤3次，每次10 min，加入1∶400稀释的兔抗EGFP IgG(一抗)，室温作用1 h，洗涤3次后，加入1∶8 000羊抗兔HRP IgG 二抗，室温孵育1 h，再用上述方法洗涤后加加入DAB显色液，均匀滴加到PVDF膜上，显色。

1.8ORF047基因编码蛋白亚细胞定位观察及分析同1.5中确定pEGFP-ORF047能够在细胞内表达，试验前在24孔细胞培养板中加入灭菌的细胞爬片，按照转染293T细胞的方法，将pEGFP-ORF047质粒与pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER质粒分别共转染Vero-E6细胞。转染36h后，弃掉培养基，用PBS轻轻冲洗两次，最后加入PBS维持，轻轻用镊子夹出细胞爬片，置于激光共聚焦显微镜下对样品进行扫描观察荧光蛋白表达状况，结果用LSM Image Browser软件进行分析。

2　结　果

2.1ORF-047基因扩增以提取的病毒基因组DNA作为模板，经PCR成功地扩增包含有ORFV ORF047基因完整开放阅读框的基因片段，见图1，与预计大小相符。

M: DL2000 DNA marker; 1-2: PCR products图1　 ORF-047 PCR 产物电泳结果Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2pEGFP-ORF047重组质粒的鉴定以质粒 pEGM-ORF047为模板， PCR 扩增后得到约 750 bp左右的基因片段， 酶切后插入真核表达载体 pEGFP-N1，得到pEGFP-ORF047重组质粒。pEGFP-N1质粒及PCR片段经HindⅢ和BamHⅠ酶切后得到约为 4. 7 kb 的 pEGFP-N1 片段和约 735 bp的 ORF047 基因片段，测序证实目的基因ORF准确插入到载体中，见图2。

M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products; 2: Product digested by BamHI+Hind III图2　pEGFP-ORF-047重组质粒酶切鉴定结果Fig.2　Restriction enzyme analysis result of recombinant plasmid pEGFP-ORF-047

2.3Western bloting结果利用倒置荧光显微镜观察转染效率。 转染48 h后收集的细胞SDS-PAGE电泳后，Western bloting检测结果：pEGFP-N1空载体出现约27Kd的目的条带，而细胞对照无条带, 推测ORF047与EGFP 融合蛋白相对分子质量约为 54Kd，结果在相应的位置出现 1 条特异性的蛋白杂交带，说明目的蛋白得到正确表达，见图3A、B。

M: Protein mark; 1 pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells; 2:293T cells; 3: pEGFP-N1 plasmid transfected into 293T cells图3A　pEGF-PORF-047重组质粒转染293T细胞Fig.3A　pEGF-ORF-047 plasmid transfected into 293T cells图3B　pEGF-PORF-047重组质粒转染293T细胞表达的western blotting鉴定Fig.3B　Western blotting of pEGF-ORF-047-N1 plasmid transfected into 293T cells

2.4ORF047基因编码蛋白亚细胞定位pEGFP-ORF047质粒与pHcRed1-Nuc、pHcRed1-Mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞，36h后荧光共聚焦显微镜观测结果显示，在共转染pEGFP-ORF047+pHcRed1-Nuc质粒的细胞中，pEGFP--ORF047表达的带有绿色荧光的蛋白，弥散性的分布于细胞的胞浆中，不能够与靶向定位的pHcRed1-Nuc表达红色荧光蛋白重叠；同样pEGFP-ORF047表达的带有绿色荧光蛋白也不能够与pHcRed1-ER表达的发红色荧光蛋白重合；但是部分与pHcRed1-Mito表达的红色荧光蛋白有一定的重叠而显示黄光，这说明ORF047基因编码的蛋白主要定位在胞浆中，少量分布在线粒体中，见图4。

红色荧光为线粒体、细胞核、内质网荧光蛋白RFP发射荧光；绿色荧光代表绿色荧光蛋白GFP发射荧光；黄色代表共定位。a-c: pEGFP-ORF047+ pHcRed1-Nuclear plasmid transfected into vero-E6 cell; d-f: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Endoplasmic reticulum transfected into vero-E6 cell; h-j: pEGFP-ORF047+pHcRed1-Mtochondria transfected into vero-E6 图4　共聚焦显微镜下观察 pEGFP-ORF047表达蛋白在Vero-E6细胞中的定位Fig.4　Results of pEGFP-ORF047 expressed protein subcellular localization in Vero-E6 cell by cofocal (Scale bar=10 μm)

3　讨　论

ORFV是痘病毒科、副痘病毒属的成员，可引起人、绵羊、山羊以及多种野生动物接触性感染，羊传染性的暴发和流行不但严重危害养羊产业的健康发展而且威胁人们的身体健康[5-6]。

在VACV中 L1R蛋白是参与入侵融合复合物的重要蛋白之一，其暴露于MV的表面。研究表明，针对L1R的特异性抗体、单克隆抗体可以减弱VACA诱导的细胞融合，也可抑制病毒的入侵，强烈中和病毒的感染[7]。L1R蛋白在N端有一甘氨酸残基发生豆蔻酰化和3个分子内二硫键，如果突变N 端的甘氨酸不仅阻止VACA的感染，也改变了L1R在胞内的位置，减少了胞内二硫键结合的构象，这证明了L1R在形成复合物的重要性[8]。也有研究证实L1R蛋白是细胞入侵和膜融合的必需分子，且不依赖细胞表面的GAG[9]。此外，表达的可溶性的L1R蛋白可阻断病毒的入侵，并且能与细胞表面结合，因此证明L1R蛋白是一种细胞表面受体结合蛋白[10-11]。

VACV的L1R研究的较多，但是对于羊口疮ORF047编码的L1R还未见有研究报道。本研究先克隆了ORFV ORF047基因，与参考的序列核苷酸/氨基酸序列一致性达到98%以上。将该基因片段插入pEGFP-N1，构建了pEGFP-ORF047真核表达载体，瞬时转染细胞后经过培养，在荧光显微镜下观察到已经表达融合蛋白的细胞，通过 Western blotting 试验验证了融合蛋白的大小。本试验对 pEGFP-ORF047表达蛋白的研究中也利用荧光共聚焦显微镜观测不仅可以观察到重组质粒pEGFP-ORF047在Vero-E6细胞中成功表达而且明确其主要表达的位置在胞浆中，线粒体中也有少量的表达。

本研究的结果，对后续研究ORFV编码的L1黏膜蛋白是否与VACV上编码的L1在其入侵过程中发挥一样作用机制提供一定的基础。

参考文献：

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