刘健慧,　张晓丹,　周　愿,　单亦初,　方　菲,　张丽华*,　张玉奎(. 中国科学院分离分析化学重点实验室, 中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 6023; 2. 中国科学院大学, 北京 00049)

近年来,蛋白质组定量方法的不断发展推动了生物学与精准医学等领域的深入理解。在实现准确定量的前提下,多时空变化、多变量、大样本量的蛋白质组定量分析[1-4]可以更精准地揭示生物过程的发生发展机制,寻找重要的疾病标志物。因此,高通量的样品预处理及定量分析已经成为近年来蛋白质组学方法发展的趋势。

为了提高蛋白质组定量准确度,本课题组前期开发了基于质量亏损的准等重二甲基化标记(pIDL[5])策略,利用相差5.84 mDa的低相对分子质量的成对碎片离子可以实现基于二级谱的蛋白质组学相对定量。该方法定量结果与理论值相对偏差低于2%,动态范围达到4个数量级,定量结果优于现有基于MS1和MS/MS的相对定量方法,具有很高的定量准确度,并已在基于鸟枪法的全蛋白质组定量分析[5,6]、完整蛋白质定量分析[7]等领域得到了广泛的应用。为了增加该方法的分析通量,可以结合选择性二甲基化交叉标记策略[8,9]实现多样品的等重标记及同时定量分析。但选择性二甲基化标记策略需要两步反应,其间需要进行溶剂交换操作。目前常见的标记方法为自由溶液反应结合固相萃取(SPE)柱溶剂交换,或在SPE柱上固相标记。自由溶液反应结合SPE柱溶剂交换方法[9]操作较复杂,需要固相萃取及冻干重溶等多步繁琐的样品预处理,样品损失较大,且影响不同样品之间的定量准确度;与之相比,SPE柱上固相标记策略[8]两步标记反应均在柱上进行,标记肽段无需反复洗脱,且溶剂置换过程简便,更利于实验操作。但目前的装置难以控制反应时间且难以同时进行多样本标记,限制了其大规模的应用。

StageTip[10-12]、商品化ZipTip等集成化蛋白质组样品预处理装置凭借高效的脱盐、富集、分级能力及操作简便性,在大批量的样品预处理过程中得到了广泛的应用。其高效的溶剂交换能力及多样品同时处理能力也大大有利于选择性二甲基化标记策略。但目前,由于该装置难以控制标记反应时间,仍未应用于蛋白质组选择性二甲基化标记策略中。

基于此,本文将C18填料装填入移液枪头中,制成了StageTip标记装置,通过控制离心力的大小保证标记反应时间及溶剂交换,发展了一种基于pIDL标记策略的高通量肽段选择性交叉标记装置(pIDL-StageTip),并优化了标记试剂的反应条件,用标准蛋白质及人源全蛋白质组酶解产物评价了其标记效率及选择性、定量准确度及精密度。

1　实验部分

1.1　仪器、试剂与材料

乙腈(ACN)与甲醇购自Merck公司(德国),冰乙酸(CH3COOH)购自天津市大茂化学试剂厂,磷酸一氢钠与磷酸二氢钠购自天津市科密欧化学试剂开发中心,牛血清白蛋白(BSA)、甲醛及其同位素试剂(CH2O、13CH2O、13CD2O、CD2O)、氰基硼氢化钠(NaBH3CN)、氰基硼氘化钠(NaBD3CN)、重水(D2O)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)购自Sigma-Aldrich公司(美国)。所有实验用水均经过Milli-Q system (Millipore公司,美国)纯化。

圆盘形SPE萃取膜购自3M公司(美国), 200 μL吸嘴、离心管购自Axygen公司(美国), C18硅胶填料(粒径5 μm,孔径15 nm)购自天津博纳艾杰尔科技有限公司,C18分离材料(粒径1.9 μm)购自Dr. Maisch公司(德国)。离心机购自Sigma公司(美国)。采用ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF质谱仪(布鲁克公司,德国)与EASY-nLC 1000高效液相色谱-Q-Exactive质谱联用系统(赛默飞世尔科技公司,美国)评价效果。

图 1　pIDL-StageTip制作的示意图Fig. 1　Schematic representation of pseudo-isobaric dimethyl labeling-StageTips (pIDL-StageTips) production

1.2　选择性二甲基化标记装置的构建

构建步骤如图1所示,将圆盘形SPE萃取膜裁剪成小块,填入200 μL吸嘴中压实。用钻头或钝针等粗杆在离心管盖上钻孔。控制孔大小,使吸嘴的高度低于离心机腔体高度,且吸嘴的下尖端高于离心管底0.5 cm以上。将吸嘴固定于带孔的离心管上。将6 mg C18填料溶于150 μL甲醇中,离心填入填料并高转速压实,即可制得pIDL-StageTip装置。

1.3　牛血清白蛋白(BSA)及细胞株YTS酶解产物的标记与分析

对肽段进行选择性二甲基化标记,流程如图2所示。

图 2　肽段选择性二甲基化标记流程图Fig. 2　Flow chart for labeling steps of pIDL-StageTips

1.3.1pIDL-StageTip的活化、平衡和上样

将200 μL 50%(v/v)ACN水溶液加入装置中离心,重复多次,活化pIDL-StageTip。再用水相反复平衡,将BSA酶解产物加入装置中,离心上样,重复上样3次。

1.3.2酸性条件下二甲基化选择性标记肽段N端

在160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入20 μL相应的4%(v/v)甲醛及其同位素试剂和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氘化钠,或在180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入10 μL相应的4%(v/v)甲醛及其同位素试剂和10 μL 0.6 mol/L 氰基硼氢化钠，配制成标记反应液。将反应液加入pIDL-StageTip中,利用1 500 g的离心力保证反应液逐渐流过C18填料,离心使标记试剂与肽段N端氨基反应。

1.3.3反应试剂冲洗及溶剂交换

加入水相冲洗标记试剂,再加入50 mmol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液,置换pIDL-StageTip至碱性条件。

1.3.4碱性条件下二甲基化标记肽段C端

在160 μL的50 mmol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液中加入20 μL相应的4%(v/v)甲醛及其同位素试剂和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氢/氘化钠,配制成标记反应液。将反应液加入pIDL-StageTip中,同酸性条件下操作,利用1 500 g的离心力反应10 min,使标记试剂与肽段C端赖氨酸上氨基反应。

1.3.5反应试剂的冲洗及洗脱

加入水相冲洗标记试剂,再加入80%(v/v) ACN水溶液反复洗脱标记后的肽段,收集洗脱液,待MALDI-TOF检测。

1.3.6MALDI-TOF质谱分析

将7 mg/mL CHCA基质溶解于含0.1%(v/v) TFA的ACN/H2O(6∶4, v/v)溶液中。取2 μL标记后的肽段洗脱液点靶,干燥后再取2 μL CHCA基质点靶。干燥后进行MALDI-TOF分析。

1.3.7LC-MS质谱分析

高效液相色谱分离体系的流动相A为98%H2O+2%ACN+0.1%FA(均为体积分数,下同), B为98%ACN+2%H2O+0.1%FA。在C18毛细管分离柱(150 mm×100 μm)上以600 nL/min的流速梯度分离肽段:2%B(0 min)～6%B(0.1 min)～25%B (80 min)～40%B (110 min)～80%B (115 min)～80%B (125 min)。

Q-Exactive质谱仪采集模式为正离子模式,一级谱扫描范围为m/z300～1 800,分辨率为70 000,自动增益控制(AGC)为3×106,最大离子注入时间为60 ms;二级谱分辨率为35 000,自动增益控制(AGC)为2×105,最大离子注入时间为110 ms,取TopN=12(前12强),隔离窗口m/z2.0,从m/z50.0开始采集,碰撞能量(NCE)为28。

2　结果与讨论

2.1　装置的设计

选择性二甲基化交叉标记反应是根据肽段的N末端氨基和C末端赖氨酸侧链氨基在pH酸性条件下反应速度不同的性质,依次在酸性、碱性条件下对肽段N末端和C末端进行不同的二甲基化标记的策略。该策略可以实现不同样品的等重标记及二级谱碎片离子定量,结合本课题组[5]开发的pIDL策略,可以有效地提高蛋白质组定量准确度和分析通量。为了使该策略在大量样品的定量分析中具有更高的可操作性和简便性,本文发展了基于pIDL标记策略的高通量肽段末端选择性交叉标记装置。

如图1所示,本装置结构简单,采用的吸嘴、离心管为实验室常用耗材,简单易得且成本低廉;只需要离心力即可完成装填、样品标记及溶剂置换,操作简单,可同时标记大批量样品,省时省力,满足大量样品分析的需求。由于吸嘴尖端装填C18填料,尖端压力有所增加,利于通过较低的离心力使标记试剂缓慢流过C18填料,避免压力过低时流速不可控。最终确定1 500 g的离心力下,200 μL标记试剂经10 min通过pIDL-StageTip。因此,该装置保证了标记反应时间的可控性、大量样品标记的简便性,是选择性二甲基化交叉标记反应的理想装置。

图 3　NaBD3CN体系中不同反应时间对肽段RPCFSALT-PDETYVPK标记效率及选择性的影响Fig. 3　Effect of different reaction times with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

二甲基化标记使用甲醛及其同位素试剂与伯胺反应形成希夫碱,氰基硼氢化钠或氰基硼氘化钠再将其还原成甲基。酸性条件下由于溶液中含有大量的活泼氢,会与氰基硼氘化钠中的氘原子发生明显的回交,导致标记质量误差。为避免这一现象,酸性条件下使用氰基硼氘化钠做还原剂时,选择重水作为溶液。但发现重水体系影响二甲基化反应速率,因此下面分别优化酸性条件下使用NaBD3CN和NaBH3CN作还原剂的体系,保证对肽段标记的效率及选择性。

2.2　酸性条件下NaBD3CN体系标记选择性的优化

我们采用BSA酶解产物中末端为赖氨酸的肽段考察标记效率及选择性。为了更有效地考察酸性条件下的标记选择性,这里只在酸性条件下对NaBD3CN还原的肽段N末端进行标记,选择标记试剂为13CH2O与NaBD3CN,标记时间分别为10、20、30 min,考察可以实现N端完全标记且不会标记C末端赖氨酸的最佳反应时间。

如图3所示,肽段RPCFSALTPDETYVPK自10 min起即标记完全,原始肽段质荷比1 881处肽段峰消失,标记后N末端增加32 Da,肽段质荷比1 913处出现肽段峰。由肽段峰面积计算,标记效率为100%。说明该装置对肽段N端标记效率高,增加标记时间对标记效率并没有明显的影响。同时,为了避免酸性条件下对肽段C末端的赖氨酸同时标记,使标记选择性降低,考察了标记时间对选择性的影响。如果C末端的赖氨酸进行了标记,肽段质荷比为1 945。如图3所示,标记10 min时未出现赖氨酸上非选择性标记峰,标记选择性100%。但20 min后,随着反应时间的增加,赖氨酸上发生标记的现象更加明显,说明反应时间过长会使标记选择性有所降低,故选择10 min作为酸性条件下NaBD3CN体系的标记时间较合理。

图 4　NaBD3CN体系中不同反应时间对肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK标记效率及选择性的影响Fig. 4　Effect of different reaction time with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK

为了考察不同肽段的标记最优条件是否存在明显差别,考察了肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK的标记效果。如图4所示,与肽段RPCFSALTPDETYVPK标记情况相似,原始肽段峰(m/z2 493)10 min后即消失,出现增加32 Da的N端标记后肽段峰(m/z2 525)。标记10 min时未见赖氨酸上非选择性标记峰出现,标记选择性仍可达到100%。但20 min后,随着反应时间的增长,在质荷比2 557处出现强度越来越强的非选择性赖氨酸二甲基化标记肽段峰。说明该反应条件对不同肽段的标记无明显差异性。为了同时确保标记效率及选择性,最终确定酸性条件下NaBD3CN体系的标记条件为:160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH重水溶液中加入20 μL甲醛及其同位素试剂和20 μL NaBD3CN,配制成标记反应液,pIDL-StageTip装置固相标记10 min。

2.3　酸性条件下NaBH3CN体系标记选择性的优化

将酸性条件下NaBD3CN体系优化的反应条件应用于NaBH3CN体系中,发现C末端的赖氨酸标记现象明显。以肽段RPCFSALTPDETYVPK为例(见图5),利用13CH2O与NaBH3CN进行标记,N末端增加30 Da,肽段N端标记处(m/z1 911)峰强度最强,原始肽段处(m/z1 881)峰消失,但也出现了赖氨酸上非选择性标记峰(m/z1 941)。相较于酸性条件下的NaBD3CN体系,标记选择性较差,故需进一步优化该体系的反应条件。

图 5　相同酸性条件下NaBD3CN与NaBH3CN标记选择性的差异Fig. 5　Differences of labeling selectivity between NaBD3CN and NaBH3CN under the same acidic condition

考虑到控制与NaBD3CN体系相同的标记时间有助于多种标记试剂的同时标记操作,故尝试通过降低标记试剂浓度以提高标记选择性。选择总体积200 μL的反应液中含1、5或10 μL 4%(v/v) CH2O和0.6 mol/L NaBH3CN的标记试剂进行实验。同样选择肽段RPCFSALTPDETYVPK为考察对象,如图6所示,加入1 μL标记试剂后,原始肽段(m/z1 881)仍有很多未标记；加入5 μL标记试剂后标记效率明显增高；加入10 μL标记试剂后原始肽段峰消失,标记效率达100%,实现了肽段的完全标记。3个标记浓度产生的赖氨酸非选择性标记(m/z1 937)均不明显,加入10 μL标记试剂后,标记选择性达95%。因此,确定酸性条件下NaBH3CN体系的标记条件为:180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH水溶液中加入10 μL 4%(v/v)甲醛及其同位素试剂和10 μL 0.6 mol/L NaBH3CN,配制成标记反应液,pIDL-StageTip装置固相标记10 min。

图 6　NaBH3CN体系不同标记试剂浓度对肽段RPCFSALT-PDETYVPK标记效率及选择性的影响Fig. 6　Effect of different reagent concentrations with NaBH3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

图 7　pIDL-StageTip装置对肽段RPCFSALTPDETYVPK的标记效果Fig. 7　Labeling performance of peptide RPCFSALT-PDETYVPK using pIDL-StageTip

2.4　装置标记效果评价

使用优化后的条件,依次进行酸性条件、碱性条件下的标记即可完成肽段两端的两步标记。选择13CD2O和NaBD3CN在酸性条件下标记肽段N端(36N),选择CD2O和NaBH3CN在碱性条件下标记肽段C端(32KH),考察整个装置两步标记后的标记效果。36N-32KH标记后肽段共增加68 Da。如图7所示,原始肽段RPCFSALTPDETYVPK上样后,样品溶液中无肽段峰,说明上样完全,无样品损失。标记后,m/z1 881处峰消失,m/z1 949处出现肽段峰,说明标记效率高,整套装置可完成肽段两端的两步标记。

2.5　对复杂体系的标记及定量效果

蛋白质组研究对象常为由众多蛋白质组成的复杂混合体系,为了满足蛋白质组的研究需求,评价装置的普适性,进一步利用人NK/T细胞淋巴瘤细胞株YTS酶解产物考察本装置在复杂蛋白质组体系下的标记及定量效果。

对于酸性条件下的NaBH3CN体系,选择13CH2O和NaBH3CN在酸性条件下标记肽段N端(30NL), CD2O和NaBD3CN在碱性条件下标记肽段C端(34KH),该种标记简写为30NL-34KH。对于酸性条件下NaBD3CN的体系,选择CH2O和NaBD3CN在酸性条件下标记肽段N端(30NH),13CD2O和NaBH3CN在碱性条件下标记肽段C端(34KL),该种标记简写为30NH-34KL。接着对样品进行LC-MS分析,鉴定时将肽段N端、C端的修饰及相应的非选择性修饰都设置为可变修饰。通过计算鉴定到的各种修饰肽段的谱图数,确定其标记效率及选择性。结果表明,30NL-34KH的标记效率为99.96%±0.06%,标记选择性为100%±0.00%。30NH-34KL的标记效率为99.92%±0.02%,标记选择性为100%±0.01%。说明该装置对复杂蛋白质组样品标记仍具有很高的标记效率及选择性,对于大规模蛋白质样品标记具有广泛的应用前景。

图 8　质量比1∶1和 1∶10混合的人源复杂酶解产物定量比值箱线图Fig. 8　Box plots for complex human digests at the mixing mass ratios of 1∶1 and 1∶10

将上述两种标记产物分别按照重标与轻标1∶1和1∶10(w/w)混合,考察基于该装置定量方法的准确度及精密度。蛋白质的定量比值的箱线图如图8所示,每种混合比例分别进行3次质谱重复测试,取定量到2次及2次以上的蛋白质进行分析。1∶1及1∶10混合的样品定量比值的中值分别为0.94及0.08,相应的相对误差为6.0%及20%。定量比值的分布很窄,取其以2为底的对数后SD值分别为0.19及0.19。对每个样品质谱重复3次,3次技术重复定量比值的RSD值的中值分别为5.92%及9.43%。上述结果证明,利用该装置标记样品不会引入由标记效率、洗脱效率等方面造成的误差,具有很高的定量准确度及精密度,有利于蛋白质组学的准确定量。

3　结论

本文发展了一种基于pIDL标记策略的高通量肽段末端选择性交叉标记装置,该装置可以保证固相标记反应时间的可控性、大量样品两步标记的简便性。实验优化了酸性条件下NaBD3CN与NaBH3CN体系的标记反应条件,实现了对标准蛋白质及人源蛋白质组复杂体系酶解产物高标记效率、高选择性的二甲基化标记,有利于蛋白质组的高准确度、高精密度定量分析。整套标记可以在2 h内完成。该特点将利于细胞、组织、血液、尿液等蛋白质组样品的多变量分析,实现高可操作性、高准确度、高通量的蛋白质组定量标记。

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