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帕金森病（Parkinson disease，PD）是神经系统变性疾病，临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等。当临床症状出现时，黑质-纹状体系统己有50%～70%的多巴胺能神经元缺失[1]。PD主要发病年龄为40～70岁，发病率随年龄增长而增加[2]。PD的主要病理变化包括多巴胺能神经元变性，Lewy体形成和纹状体多巴胺减少等[3]。PD的病因包括遗传易感性、环境毒素的作用和衰老，其发病可能是多种因素的共同作用。PD的治疗方案多为对症治疗，包括补充左旋多巴，多巴胺激动剂和MAOB抑制剂等，但这只能缓解症状，并不能阻断或逆转疾病的发生与发展。

Hoehn-Yahr分级表是用来纪录帕金森症病情的分级表[4]。分级从0期～5期，用于评估患者的残障级别。基因芯片是采用高通量方法来获取生物信息的一种技术，可用来分析疾病与正常组织之间的差异基因，进一步分析为可为临床研究提供新的线索[5，6]。本研究利用来自基因芯片公共数据库Gene Expression Omnibus（GEO）的一组Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血的基因芯片进行研究，分析差异基因及核心基因涉及的生物学过程及细胞通路，有助于进一步阐明Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

基因表达谱数据来源于基因表达综合数据库GEO[7]，材料为未经过治疗的Hoehn-Yahr分级为1期PD患者的外周血浆RNA测序数据。采用的实验平台是Illumina公司GPL10558芯片的8个样本。GEO登陆号GSM1318547-GSM1318550为Hoehn-Yahr分级为1期PD患者外周血的数据；登陆号GSM1318552-GSM1318555为健康对照组外周血数据[8]。

1.2 方法

1.2.1 分析软件本实验使用的GEO2R是基于R语言，GEO数据库自带的差异基因在线分析软件。DAVID（Database for annotation，visualization and integrated discovery 6.8）为在线基因功能注释分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/），STRING（Functional proteinassociation networks 10.0）为在线蛋白-蛋白相互作用网络分析工具（http：//www.string-db.org/）。CytoScape 3.4是一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件。

1.2.2 分析方法差异表达基因分析采用GEO数据库的GEO2R在线分析工具进行差异表达基因分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。本研究中多重假设检验控制采用Benjamini和Hochberg提出的假阳性率控制法[9]。差异基因筛选标准：P＜0.05，基因表达值倍数变化（log FC）的绝对值＞1。

将差异基因导入在线分析软件DAVID中，对差异表达基因进行功能富集分析和KEGG通路分析。对这些基因进行生物学解释，P＜0.05为具有统计学意义。

再将上调的差异基因导入在线分析软件STRING中，对差异基因所编码的蛋白进行相互作用分析，互作评分combination score＞0.4为存在互作的阈值条件。筛选掉与其他基因编码的蛋白孤立的点，最终形成蛋白相互作用的网络图。将STRING所得的蛋白互作的网络数据导入CytoScape软件，利用CytoScape筛选核心基因[10-12]。

2 结果

2.1 差异基因的GO富集分析和通路分析

利用GEO2R差异基因在线分析软件从Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血的基因芯片GSE54536数据集中共筛选出997个差异基因，其中上调的差异基因有606个，下调的差异基因有391个。

通过对差异基因的DAVID富集分析，上调的基因主要涉及形态发生时的解剖结构形成过程、动作电位、肌肉系统的运动过程、大脑的发育、细胞间的信号传导、多细胞生物信号传递、心血管系统的发育等生物学过程。分子功能表明，上调的差异基因主要涉及SAMD蛋白的结合及核苷三磷酸酶调节活性。下调的基因主要涉及B细胞受体信号通路、负趋化性过程、发育过程中涉及的凋亡过程、细胞分泌、核苷酸磷酸化等生物学过程。还涉及到细胞膜、免疫球蛋白复合物、轴突部分及蛋白质的细胞外基质等的组成。分子功能表明，下调的差异基因主要涉及蛋白复合物的形成。排在前10位的差异基因的DAVID分析结果见表1。

通过对差异基因的KEGG分析，上调的基因主要涉及蛋白多糖在癌症中的作用通路和胆碱能突触通路。下调的基因主要涉及原发性免疫缺陷通路，造血细胞系通路，肠道免疫网络的IgA的产生通路，PI3KAkt信号传导通路，卵母细胞减数分裂通路，细胞因子受体相互作用通路。差异基因KEGG分析结果见表2。

2.2 差异表达基因的相互作用网络分析

将上调的差异基因导入在线分析软件STRING中，除去孤立无互作的蛋白节点，筛选出501个上调基因编码的蛋白质具有相互作用关系。再把STRING所得的蛋白互作的网络数据导入CytoScape软件，以节点的边Degree＞10为标准筛选中心节点，选取排在前10位的核心基因，见表3。

3 讨论

PD是一种进行性的中枢神经系统变性疾病，主要原因是多巴胺能神经元变性导致神经元死亡。随着基因组及蛋白质组技术的成熟及广泛应用，大量PD相关的基因被报道并证实[13]。通过对这些信息的再研究，可以进一步探索PD的发病机制。目前对于PD的研究大多数为疾病中晚期或正在接受治疗的患者，然而这些研究结果不能代表疾病初始阶段的病理机制。但是对PD患者在症状发生前进行脑部内在病理过程的研究几乎不可能，因此引起PD的具体病理机制至今尚不清楚。

本研究通过对Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因进行差异表达分析，希望在转录水平研究PD的发病机制，提示PD为多种基因，多种分子机制相互作用的结果，对于PD早期的病理机制的阐明具有重要意义。

通过对差异基因的筛选及分析，笔者发现差异基因主要涉及形态发生时的解剖结构形成过程，动作电位，肌肉系统的运动过程，大脑的发育，细胞间的信号传导，多细胞生物信号传递，心血管系统的发育等生物学过程。B细胞受体信号通路，负趋化性过程，发育过程中涉及的凋亡过程，细胞分泌，核苷酸磷酸化等生物学过程。还涉及到细胞膜，免疫球蛋白复合物，轴突部分以及蛋白质的细胞外基质等的组成。分子功能表明，差异基因主要涉及蛋白复合物的形成，SAMD蛋白的结合以及核苷三磷酸酶调节活性。通过KEGG发现，差异基因主要涉及蛋白多糖在癌症中的作用通路和胆碱能突触通路，原发性免疫缺陷通路，造血细胞系通路，肠道免疫网络的IgA的产生通路，PI3K-Akt信号传导通路，卵母细胞减数分裂通路，细胞因子受体相互作用通路。这些结果与其他一些通过生物信息学方法研究PD的文章具有很大的联系[14-16]。提示可以从外周血中的差异基因的分子功能和通路去研究PD患者潜在的发病机制。

表1 差异基因的富集分析

表2 差异基因所涉及的生物学通路

表3 Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因差异表达分析上调核心蛋白

核心基因c-fos属于早期反应基因，可以对细胞外的信号产生兴奋性反应，Fos是c-fos的蛋白产物。在基底核区刺激多巴胺受体可诱导Fos的表达。因为多巴胺D1及D2受体分别表达在直接通路的纹状体黑质神经元和间接通路的纹状体苍白球神经元上，所以Fos的表达可以反映直接通路和间接通路的活动[17]。c-fos基因与PD的发病具有密切联系。核心基因KDM6B又名Jmjd3，在PD的免疫学发病机制中，特别是小胶质细胞表型的表观遗传调控中起着重要作用。经典激活（M1表型）和替代激活（M2型）是小胶质细胞活化状态的两极，可以对中枢神经系统产生不利或有益的影响。研究表明，JMJD3可以通过修改组蛋白H3K27me3提高M2型小胶质细胞的极化，因此它在小胶质细胞表型的开关中发挥关键作用，可能有助于研究PD的免疫发病机制[18]。核心基因ESR1与PD的易感性密切相关。Gao等[19]通过meta分析相关的病例对照研究，发现VDR、ESR1和ESR2的基因多态性与PD的易感性密切相关，VDR、ESR1和ESR2的基因多态性可以增加PD的发病率。

其他核心基因大多数与肿瘤有密切联系。CCND1与乳腺癌有关，miR-520a-3p可以通过在转录后水平抑制CCND1和CD44的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，miR-520a-3p可能成为未来治疗乳腺癌的靶点之一[20]。Egr-1基因在绝大多数的肿瘤中均有表达，肿瘤细胞经过放射治疗后可以诱导Egr-1基因表达，同时引起其下游基因表达及细胞凋亡，放射治疗后的Egr-1基因表达水平与肿瘤细胞凋亡有关[21]。TCF7L2作为2型糖尿病的易感基因，以及IL8基因，都与乳腺癌的发病也存在一定联系。MAPK-7与骨肉瘤有密切联系[22-24]。HDAC8与肝细胞性肝癌具有相关性[25]。这些核心基因与PD的关系，有待于进一步研究。

综上所述，本研究利用生物信息学工具，分析了Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因的变化情况。结果显示，与正常对照组相比，Hoehn-Yahr分级为1期的PD患者外周血基因表达变化模式存在明显的差异，提示PD为多种基因，多种分子机制相互作用的结果。筛选得到的关键基因，如FOS、KDM6B、ESR1等，在PD的发病机制中可能起了重要作用，值得进一步深入研究。对于PD早期外周血基因表达差异的研究，有助于进一步揭示PD早期的病理过程，对疾病的早期诊断及治疗具有重要意义。

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