冯方，加藤伸郎，王芙蓉

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年性痴呆，是以进行性认知功能障碍为特点的中枢神经系统退行性病变。患者可出现以记忆、定向、智力、判断、执行功能障及人格和行为改变等为特点的全面性痴呆。AD的病理特征是β淀粉样蛋白（βamyloid protein，Aβ）沉积形成老年斑（senile plaque，SP），过度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）及进行性颞叶和海马等部位神经元脱失[1-3]。大脑海马长时程增强（long term potentiation，LTP）是与学习记忆有关的一种活动依赖性突触可塑性模型，广泛应用于学习记忆的机制研究中[4，5]。既往研究表明，一定频率光刺激可改善20～25周青年3xTg痴呆小鼠的认知功能[6]。本研究对3xTg AD模型小鼠（APP、Tau及PS1三重转基因小鼠）进行光刺激，以探讨光刺激对AD小鼠海马组织LTP及Aβ含量的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

SPF级4～6月3xTg AD小鼠20只，同基因背景野生型4～6月小鼠10只，雌雄各半，体质量25～35 g，由加藤伸郎教授（日本金泽医科大学生理学系）提供；均饲养在华中科技大学附属同济医院动物实验中心SPF级动物饲养房，严格遵守SPF级动物操作规范，12 h光照循环。Aβ酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，水合氯醛购于武汉赛维尔生物技术有限公司，酶标仪购于瑞士Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组及模型制作3xTgAD小鼠随机分为光刺激（PS）组和未刺激（NS）组，野生型小鼠纳入对照组，各10只。PS组在12 h黑暗期间额外接受光刺激，在笼顶约30 cm高处放置一盏由控制装置点亮的卤素灯，该控制装置为临床用事件相关脑电图诱发设备，刺激光源是频率为2 Hz，强度为300勒克斯的闪烁光。PS组小鼠每日接受光刺激，持续4周。NS组及对照组小鼠不接受额外光刺激，其余实验条件均相同。

1.2.2 海马突触LTP检测制作脑片：各组随机选取5只小鼠，10%水合氯醛麻醉后快速断头取脑，将脑组织置于4℃人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，ACSF中通以95%O2和5%CO2混合气体，分离出双侧海马，用震动切片机切成厚度为400 μm的脑片。将脑片置于持续通氧的ACSF中，室温22～25℃下孵育2 h，之后将脑片移至30℃恒温浴槽中，以2.0～2.5 mL/min的速度持续灌流ACSF，并持续通入上述含氧混合气体。

诱导离体海马组织的LTP：将脑片移入记录槽中心，以3 mL/min的速度持续灌流氧饱和ACSF，显微镜下找到海马CA1区。将刺激电极放在shaffer纤维上，记录电极放在海马CA1区的辐射层。测试时刺激电极每隔30 s给出1个0.033 Hz、波宽100 μs的刺激。刺激强度由小到大，每次刺激记录相应的兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential，EPSP），观察记录fEPSP幅值，通过测量fEPSP斜率确定突触传递强度。选择fEPSP最大值的25%刺激强度作为最终刺激强度，记录30 min fEPSP作为基线，之后给予高频串刺激（high frequency stimulaiton，HFS）诱导LTP，HFS为5串100 Hz的刺激，每串5个脉冲，串间隔200 ms。HFS诱发LTP后用1次/5min的检测方波检测并记录fEPSP斜率。

1.2.3 ELISA法检测小鼠海马组织内Aβ含量4周光刺激完成后，随机从各组选取5只小鼠，水合氯醛麻醉后断头取脑，将海马组织分离，提取海马总蛋白。按ELISA试剂盒说明检测Aβ含量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HFS诱导后各组海马兴奋性突触后电位斜率

各组高频强直刺激后成功诱发LTP并持续记录120 min，3组间各个时间点fEPSP斜率差异有统计学意义（P＜0.05）。NS组fEPSP斜率明显低于对照组（P＜0.05），PS组fEPSP斜率明显高于NS组（P＜0.05）。这表明与对照组相比，NS组LTP明显受抑，PS组较NS组LTP明显增强（均P＜0.05），见表1、图1。

表1 各组小鼠HFS诱导后海马fEPSP斜率比较（mV/ms，±s）

表1 各组小鼠HFS诱导后海马fEPSP斜率比较（mV/ms，±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与NS组比较，②P＜0.05

组别对照组NS组PS组只数10 10 10 30 min 1.75±0.54 0.91±0.37①1.43±0.48②60 min 1.79±0.62 0.95±0.42①1.55±0.58②90 min 1.93±0.43 1.19±0.35①1.67±0.62②120 min 1.88±0.58 1.22±0.32①1.63±0.49②

图1 各组小鼠HFS诱导后不同时间点海马fEPSP斜率

2.2 各组小鼠海马组织中Aβ含量

光刺激能逆转3xTg AD小鼠脑组织中Aβ的沉积。对照组海马组织表达少量Aβ，NS组Aβ蛋白的表达较对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；PS组Aβ的沉积较NS组明显减少（P＜0.05）。提示光刺激可能逆转3xTg AD小鼠脑组织中Aβ蛋白的沉积，减轻神经毒性作用，见图2。

图2 各组小鼠海马组织内Aβ蛋白含量

3 讨论

随着社会老龄化，AD的患病逐年增加[7]。我国现今约有1000万痴呆患者，AD约占据其中的50%～70%[8，9]。进行性加重的认知功能障碍严重影响患者的生活质量，也加重家庭与社会的负担，但目前并无有效的治疗手段。在生物、化学方法的尝试外，目前已有较多的物理方法的尝试，试图通过物理刺激来调节突触可塑性等，如电刺激（ECS）[10，11]、重复经颅磁刺激（rTMS）[12，13]并已取得了较为可观的研究成果，而光刺激在这一领域的研究相对较少。既往有研究认为一定频率光刺激可改善20～25周青年3xTg小鼠的认知功能[6]。Aβ蛋白与Tau蛋白是AD发病过程中的关键因素[2]。Aβ由第21号染色体编码，是淀粉样蛋白前体经蛋白水解酶作用后的底物，是AD脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解启动和贯穿了AD的整个病理过程。

海马与学习记忆密切相关，是AD患者病理改变最明显的脑区之一，各种典型的AD病理改变都可出现在海马区域。当强直刺激作用于海马突触前传入纤维时，突触传递的效率可出现长时间增强的现象，即LTP。海马LTP受损与记忆学习能力下降密切相关。Aβ与LTP之间的相关性目前已有了较多的研究，Ye等[14]研究表明，Aβ片段可明显抑制海马离体脑片LTP的诱导。在体研究也表明，脑室内注射Aβ片段后基础的突触传递没有受到明显的影响，但可强烈抑制海马CA1区LTP[15]。本实验通过光刺激作用于4～6月3xTg AD小鼠后，对海马LTP及Aβ进行检测，探讨光刺激对其认知功能影响的潜在机制。结果表明，一定频率的光刺激降低AD小鼠海马组织中的Aβ蛋白含量，光刺激后AD小鼠海马离体脑片fEPSP斜率明显降低。基于此实验结果，在下一步研究中将更深入对其机制进行研究，包括光刺激后AD小鼠海马内Aβ含量的降低及LTP抑制两者之间是否相关，存在何种联系。以期尽快寻找治疗AD的有效方法。

[1] Holtzman DM，Morris JC，Goate AM.Alzheimer's disease：the challenge of the second century[J].Sci Transl Med，2011，3：71-77.

[2] 陈庆华，张凤强，李立新，等.阿尔茨海默病发病机制和诊断技术研究进展[J].中华老年心脑血管病杂志，2018，20：108-110.

[3] 赵鹏，孙亚平，陈红.阿尔茨海默病发病机制探究[J].中风与神经疾病杂志，2016，33：86-89.

[4] Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice[J].J Neurosci，2006，26：1077-1087.

[5] Bliss TV，Collingridge GL.A synaptic model of memory：long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature，1993，361：31-39.

[6] Zhang Y，Nang F，Luo X，et al.Cognitive Improvement by Photic Stimulation in a Mouse Model of Alzheimer's Disease[J].Curr Alzheimer Res，2015，12：860-869.

[7] Danborg PB，Simonsen AH，Naldemar G，et al.The potential of microRNAs as biofluid markers of neurodegenerative diseases--a systematic review[J].Biomarkers，2014，19：259-268.

[8] Xu J，Nang J，Nimo A，et al.The economic burden of dementia in China，1990-2030：implications for health policy[J].Bull Norld Health Organ，2017，95：18-26.

[9] Chan KY，Nang N，Nu JJ，et al.Epidemiology of Alzheimer's disease and other forms of dementia in China，1990-2010：a systematic review and analysis[J].Lancet，2013，381：2016-2023.

[10] Berggren A，Gustafson L，Hoglund P，et al.A long-term longitudinal follow-up of depressed patients treated with ECT with special focus on development of dementia[J].JAffect Disord，2016，200：15-24.

[11] Pier KS，Briggs MC，Pasculli RM，et al.Successful electroconvulsive therapy for major depression misdiagnosed as Alzheimer dementia[J].Am J Geriatr Psychiatry，2012，20：909-910.

[12] Koch G，Bonni S，Pellicciari MC，et al.Transcranial magnetic stimulation of the precuneus enhances memory and neural activity in prodromal Alzheimer's disease[J].Neuroimage，2017，169：302-311.

[13] Leon-Sarmiento FE，Granadillo E，Bayona EA.[Present and future of the transcranial magnetic stimulation[J].Invest Clin，2013，54：74-89.

[14] Ye L，Qiao JT.Suppressive action produced by beta-amyloid peptide fragment 31-35 on long-term potentiation in rat hippocampus is N-methyl-D-aspartate receptor-independent：it's offset by(-)huperzine A[J].Neurosci Lett，1999，275：187-190.

[15] Cullen NK，Suh YH，Anwyl R，et al.Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments[J].Neuroreport，1997，8：3213-3217.