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(1.广东产品质量监督检验研究院,国家食品质量监督检验中心(广东),广东佛山 528300; 2.中国水产科学研究院南海水产研究所,广东省渔业生态环境重点实验室,广东广州 510300)

维生素B12(VB12)和叶酸均属于B族维生素,它们参与人体重要的生理代谢过程,是一类不可或缺的水溶性维生素。针对VB12和叶酸的特殊功能,为迎合消费者对营养保健食品的需求,市场上越来越多的食品中添加这类维生素,如婴幼儿配方食品、谷物产品和果汁饮料等,但其是否符合要求有待进一步确证。为了评价食品标签标注维生素含量的准确性,美国FDA和European Directive 2002/46/EC均制定了一系列检测食品中标注添加维生素含量的法规[1]。2010年我国也出台了检测食品及乳品中VB12和叶酸的国家强制性检测标准,对其含量的检测方法、检出限、适用范围等都做了明确的规定[2-4]。因此,加强VB12和叶酸检测技术的研究,对消费者的科学摄入量和监管部门的有效控制添加量具有重要意义。目前,这两类维生素的检测技术主要分为微生物法和化学分析法,其中化学分析法很难满足含量低和基质复杂的食品中的检测要求,多用于高含量的样品(如保健品、药物、复合添加剂等)[5-6],但对于含量低,且低于仪器检出限的维生素仍然需要微生物法进行测定。目前,本实验室常规检测项目是VB12、叶酸、泛酸和生物素,其中泛酸的检测方法相对比较稳定,生物素的方法可以使用等同效果的检测试剂盒,只有VB12和叶酸的检测方法为传统的微生物法,在实际应用过程中不确定因素较多,不易掌握[7]。针对上述问题,本文对VB12和叶酸这两种维生素的微生物检测方法进行归纳总结,以期为将来的检测提供指导性意见。

1 国家标准中VB12和叶酸的微生物检测法

我国现有维生素的微生物检测法依据某种微生物对特定维生素的生长依赖性,在特定条件下,其生长速度与维生素含量成一定的对应关系,从而对维生素进行定量。微生物法测定食品中的维生素源于美国官方分析家协会手册(Association of Official Analytical Chemists,AOAC),GB 5413.14-2010[2]中检测VB12和叶酸的微生物法等同采用AOAC的方法,只是格式和适用条件发生一些变化。利用微生物法检测叶酸是当前技术条件下国际官方机构唯一认可的检测方法。GB 5009.211-2014[4]食品中叶酸的测定同样采用的是微生物法。微生物法可灵敏检测出具有生物活性的维生素,体现的是基质中总维生素的含量,这是仪器分析方法难以做到的。该方法具有成本低、可操作性强、灵敏度高等优点,但同样存在一定局限性,如耗时长、准确度较低、重复性差等。

2 食品中VB12微生物检测方法的应用研究

VB12又称为氰钴素或钴胺素,因结合的基团不同,在体内有多种形式存在,以辅酶的形式参加一碳基团的代谢。它是唯一含有金属离子的水溶性维生素,在维持机体造血功能和健全神经系统功能方面起关键作用。VB12微量缺乏会引起心情压抑和慌乱,严重缺乏则易产生疲劳、神经衰弱和老年性痴呆等[8-9],因此,研究VB12微生物检测方法及技术对科学控制微量VB12在食品中的添加量具有重要的意义。

2.1 婴幼儿食品和乳品中VB12微生物检测方法的研究

我国现有的国家标准方法为传统微生物法,存在操作复杂、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题,因此如何优化现有的检测方法成为研究热点。鲁盛静等[10]针对GB 5413.14-2010[2]的测定方法,通过对整个实验过程的关键点进行控制,可获得理想的精密度和重复性,RSD值为0.01%～0.03%(n=5)。针对上述标准的优化,张丽宏等[11]则结合实际经验,从提取方法、标准曲线制备、防污染措施及菌种保存等几个方面,对该方法进行补充说明。为确定微生物法检测奶粉中水溶性维生素的波动性,刘志楠等[12]采取对同一样品进行大量实验的方法,最终确定VB12的稳定性和精密度相对较好,RSD和CV值分别为0.05%和5%。测定用菌株是微生物法中至关重要的工具,不同菌株的特异性及其生长特性是决定最终结果重复性和稳定性的重要因素。高星等[13]选用大肠杆菌定量检测奶粉中的VB12,标准曲线呈抛物线形,VB12含量与菌体生长不成正比,分析可能是奶粉中存在某些抑制菌体生长的因素,但对这种抑制因素以及如何排除它的影响,有待进一步的试验研究。

为提高微生物法测定VB12的准确性和稳定性,众多研究学者采用微孔板式微生物法检测试剂盒测定婴幼儿配方乳粉中VB12含量,相比传统方法具有操作简便、结果准确和重复性好的特点[14-19]。对商品化的试剂盒而言,影响其试验结果准确性的关键因素是标准溶液的保藏与制备,并且只做一个稀释度的样品也会对结果准确性造成影响,同时其价格昂贵,增加了检验成本。针对这一问题,科研人员把研究方向也转向基于微生物法的快速检测方法。刘冬虹等[20]在国家标准方法的基础上,使用1.2 mL PP小管替代了传统的试管,通过低温保存测试菌液,缩小试验体积,实现缩短检测周期和简化操作步骤,提高了结果准确性和重现性,为常规实验室利用微生物法快速测定VB12提供了参考。余文等[21]通过冻干莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillusleichmannii)和浓度为5 ng/mL的VB12标准品,96孔板代替传统培养,酶标仪代替紫外分光光度计,实现了快速检测。与商品化试剂盒相比,成本更低廉,适用于大批量样品检测。王旻[22]通过研究国家标准和德国拜发微生物法测VB12试剂盒,优化前处理过程,减少反应体积,并找出试剂盒标准曲线的实际质量分数,建立了实验室适用的试剂盒方法。

2.2 其他食品中VB12微生物检测方法的研究

目前,GB 5413.14-2010[2]中检测VB12方法的研究对象为婴幼儿食品和乳品,对于其他食品的检测方法尚没有明确规定。基于此,针对其他食品中VB12的检测方法陆续开展研究,主要以国家标准的方法为研究基础。微生物法中一个关键的步骤就是如何从复杂的基质中提取目标维生素,其对结果的影响占整个实验误差的很大部分[23]。因此,提取方法的优化主要基于4个方面:基质的特性;基质中维生素的存在形式(原生形式和添加形式的比重);维生素对pH和热的稳定性;分析方法的选择性和特异性。林耀文等[24]在GB 5413.14-2010[2]检测方法的基础上,通过优化样品前处理方式,建立了微生物法测定含乳饮料中VB12含量的方法,检出限可达0.04 ng/mL,有效解决了含乳饮料中VB12含量低的问题。王志伟等[25]为测定燕麦中的VB12含量,以国家标准方法为参照,对比采用添加淀粉酶的前处理方式,结果发现酶解处理法有更好的适用性。高志斌[26]通过优化微生物检测方法,测定功能性饮料中VB12的含量,该方法重现性好,灵敏度高,能够满足日常检验的定量分析。陈亚波等[27]同样也建立了微生物法检测维生素饮料中VB12的定量方法,该方法灵敏度和精密度高,测定结果准确可靠。但此方法较难掌握,需严格按照要求操作每一步,并尽量保持每次的试验条件一致,从而保证试验的重复性及符合精密度要求。蒋孟虹等[28]基于微生物法,建立了肠内营养粉剂中微量VB12含量的测定方法,该方法检测结果准确、可靠,适用于该类产品中VB12含量的测定。

3 食品中叶酸微生物检测方法的应用研究

叶酸(又称为维生素B9)是人体许多生化反应的辅酶。叶酸缺乏可引起细胞性贫血和粒细胞减少,还与新生儿神经管畸形有关,也可导致出生缺陷发生率上升,如唐氏综合症、先天性心脏病以及唇腭裂等[29]。孕妇在怀孕期间一般需要补充叶酸,缺乏可引起早产、流产等不良妊娠[30]。

微生物法测定叶酸过程中使用试管进行培养,在大批量检测时,工作量非常大,96孔酶标板的引用大大提高了工作效率。皇甫照等[31]建立了96孔板微生物法微量测定人血浆和红细胞内叶酸含量的方法,该方法培养基使用量少、检测时间短、重复性好和检测样本量大。同样是96孔板微生物法,徐文婕等[32]则将甘油冷冻保存乳酸杆菌氯霉素耐药株与96孔酶标板相结合,极大地缩短了检测时间,能测定单和多谷氨酸叶酸,灵敏度能达到ng水平,具有较高的重现性。上述两种方法均可用于其他生物组织和食品中叶酸含量的测定。张慧等[33]通过改进菌株的保存和传代,优化样液制备和加样体积,结合96孔酶标板技术,建立一种高效快速检测婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的微生物方法。该方法标准曲线相关系数为0.9992,检出限为2 μg/100 g,检测周期缩短为2 d。李飞飞等[34]考察了新型维生素检测试剂盒测定奶粉中叶酸含量的检测效果,该试剂盒具有较好地准确度、精密度和稳定性,相比国标法操作简单、结果准确、重复性好。张旺等[35]采用德国IFP微孔板试剂盒检测婴幼儿配方奶粉中叶酸质量分数,与GB 5413.16-2010[3]方法相比,降低了菌种在保存、传代中发生污染和突变的可能性,提高了实验的可操作性。为了更加精确地计算,该研究还创建了四次方程进行标准曲线的计算。同样地,唐靓等[36]也曾指出干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)标准管的OD值随着叶酸浓度增加而增长趋缓,若使用线性方程,求得的叶酸浓度不准确,建议使用4阶方程来绘制标准曲线,使计算结果更为精确。蔡双福等[37]从维生素提取、试剂与标准物质配制、菌株接种等方面对GB 5413.16-2010[3]的测定方法进行改进,使步骤简化,准确度和重现性与国标法相似。张旭等[38]比较酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)和粪链球菌(Streptococcusfaecalis)测定强化食品中叶酸的含量,经统计学分析,两种检测结果的重复性差异不大(p>0.05),实验结果差异无统计学意义,两种微生物都是良好的实验选择,为用微生物法测定叶酸提供多一种参考。唐靓等[39]将微生物法与高效液相色谱法相比较,发现前者不仅可以测定复杂样品中的化合物形式的叶酸,而且对于添加剂形式的叶酸与高效液相色谱法具有同样的准确度,其检测限可达到0.01 ng/mL。马景宏等[40]建立了用微生物法测定保健食品中叶酸含量的方法,并对其精密度和准确度进行分析,为国家标准的制订和该项目的检验提供参考。

叶酸的衍生物较多,食品中部分叶酸以与蛋白结合的方式存在,再加上干扰物的影响,使叶酸的测定具有一定困难,因此必需采用合适的样品前处理方法对叶酸进行降解和提取。曾有学者报道,20个不同实验室用微生物法检测大豆、鱼粉和早餐麦片中的叶酸含量,其中17个实验室用酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei),3个实验室用粪链球菌(Streptococcusfaecalis),上述三种产品的变异系数分别为24%、35%和24%,变异范围如此宽泛主要归因于叶酸提取的操作不同[41]。王竹[42]则采用微生物法针对不同类食物研究其前处理方法对叶酸检测结果的影响,发现适宜的前处理方法有助于获得最大检出结果。由上可见,样品前处理在叶酸的检测分析中是一个既耗时又极易引入误差的步骤,处理过程是否有效将直接影响分析结果的准确性和可靠性。

4 结论与展望

食品中VB12和叶酸的微生物检测方法正处于优化和开发创新的阶段,一方面不断研究更加简便、快捷、干扰小的样品前处理方法,一方面开发可进一步提高检测准确性和灵敏度的快速检测方法,这对规范使用与提升利用率具有较大的促进作用。微生物法作为检测维生素的经典有效方法,具有其自身的局限性,然而，随着新技术的不断发展,该方法已不再是检测维生素的黄金标准。目前,GB/T 5009.217-2008中采用高效液相色谱法检测保健食品中的VB12,该方法在检测一种或多种水溶性维生素时更加快捷、灵敏和准确[43-44]。为拓宽检测方法的应用范围,高通量、多组分同时检测将是维生素检测的主要发展趋势。任何检测方法都存在利弊,针对不同的食品基质,选择合理的检测技术,充分发挥该技术的优缺点,有效监控食品中维生素的添加量,对保证消费者的营养全面具有重要意义。